隨著人們對(duì)自由基生命研究的不斷關(guān)注，氧化應(yīng)激損傷和抗氧化保護(hù)作用的研究成為熱點(diǎn)。因人體中抗氧化的物質(zhì)有限當(dāng)氧化劑與人體內(nèi)抗氧化劑失去平衡時(shí)，人體會(huì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。當(dāng)體內(nèi)的氧化劑濃度超過(guò)細(xì)胞防御能力時(shí)，氧化損傷可引起如癌癥，多發(fā)性硬化癥和心血管疾病等疾病。目前最常見(jiàn)的是化學(xué)抗氧化劑，但因其有一定的毒副作用所以使用受到限制。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，由蛋白酶水解制得的生物活性肽具有一定的抗氧化能力，水解出的抗氧化肽與大分子蛋白質(zhì)相比，顯具有更高的生物活性，抗氧化肽在體內(nèi)積累具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的功能，能夠維持機(jī)體內(nèi)自由基的平衡，從而提高機(jī)體抗衰老和抗疾病的能力。抗氧化肽因其具有安全、高效、易吸收等特點(diǎn)，在保健、醫(yī)療等領(lǐng)域受到了管飯的重視。

綠豆又名青小豆，屬于醫(yī)食兩用作物，是我國(guó)主要的糧食作物之一，在全國(guó)多地區(qū)種植，年均產(chǎn)量在6l萬(wàn)噸且富含高質(zhì)量的植物蛋白，是優(yōu)質(zhì)的食品加工原料。食用綠豆益處繁多，如可以降低血脂、提高機(jī)體免疫力、預(yù)防衰老以及具有抗氧化等作用。綠豆多肽中的抗氧化活性肽相對(duì)分子質(zhì)量小，具有良好的水溶性、低黏度、穩(wěn)定性強(qiáng)，是天然的抗氧化劑，能夠起到清除體內(nèi)自由基、抑制生物大分子物質(zhì)過(guò)氧化的作用，具有延緩衰老、預(yù)防疾病等優(yōu)點(diǎn)，有很高的利用價(jià)值。但就目前而言，綠豆抗氧化多肽的制備工藝研究較少，不能滿(mǎn)足現(xiàn)階段的需求，生產(chǎn)成本較高，制備工藝不太成熟，對(duì)于綠豆多肽提取的研究有著重要意義。

一、材料與方法

1、材料及試劑

綠豆蛋白：實(shí)驗(yàn)室自制；鹽酸：中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；堿性蛋白酶(6000U/g)：Sigma試劑公司；氫氧化鈉、DPPH、無(wú)水乙醇：以上均為分析純，均購(gòu)自天津市科密歐試劑有限公司。

2、主要儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度儀：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；精密pH計(jì)：梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；恒溫干燥箱：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電子天平(RSJ200—4)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；離心機(jī)(TDZ5一WS)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）綠豆抗氧化肽的制備

將綠豆蛋白配置成一定濃度的溶液，水浴加熱至100℃進(jìn)行15min均質(zhì)處理。待溶液冷卻至酶解最適溫度，水浴保溫，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH調(diào)節(jié)其pH，酶解一段時(shí)間后100℃水浴滅活10min，室溫下離心(4000r／min，20min)，將上清液凍干后保存。

（2）DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照于慧等人的方法進(jìn)行DPPH自由基清除率的測(cè)定。將2mL一定濃度的綠豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH溶液進(jìn)行混合，避光于25℃條件下反應(yīng)30min，取出后于517nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光值的測(cè)定，此時(shí)吸光度值記錄為A_i；將上述過(guò)程中的2mLDPPH溶液用無(wú)水乙醇取代，然后與2mL綠豆多肽溶液進(jìn)行反應(yīng)，此條件下測(cè)定吸光值記錄為A_j，將2mL無(wú)水乙醇與2mLDPPH溶液反應(yīng)的條件作為空白組，此時(shí)記錄吸光值為Ao。
DPPH清除率計(jì)算公式如下：

A_i：樣品組吸光度值；

A_j：對(duì)照組吸光度值；

A₀：空白組吸光度值。

（3）單因素實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)在于研究酶法對(duì)綠豆蛋白水解的抗氧化肽的工藝優(yōu)化，故以DPPH為指標(biāo)，選擇酶解時(shí)間、酶解溫度、酶添加量以及pH為因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

①酶解溫度對(duì)綠豆多肽抗氧化性的影響

將底物濃度為4％、pH為9、酶解時(shí)間3h作為固定條件，測(cè)定當(dāng)酶解溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃五個(gè)條件下時(shí)的DPPH清除率。

②酶濃度對(duì)綠豆多肽抗氧化性的影響

將pH為9、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3h作為固定條件，測(cè)定當(dāng)酶濃度分別為2％、4％、6％、8％、10％五個(gè)條件下時(shí)的DPPH清除率。

③pH對(duì)綠豆多肽抗氧化性的影響

將底物濃度為4％、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3h作為固定條件，測(cè)定當(dāng)pH分別為7、8、9、10、11五個(gè)條件下時(shí)的DPPH清除率。

④酶解時(shí)間對(duì)綠豆多肽抗氧化性的影響

將底物濃度為4％、pH為9、酶解溫度50℃作為固定條件，測(cè)定當(dāng)酶解時(shí)間分別為0.5h、lh、2h、3h、4h五個(gè)條件下時(shí)的DPPH清除率。

（4）響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以篩選出各因素的三個(gè)水平。所以在此基礎(chǔ)之上，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，進(jìn)行回應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。因素和水平取值如表1所示。

二、結(jié)果與討論

1、單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）綠豆多肽抗氧化性與酶解溫度的關(guān)系

將綠豆蛋白配置成一定濃度的溶液，水浴加熱至100℃進(jìn)行15min均質(zhì)處理。待溶液冷卻至酶解最適溫度，水浴保溫，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH調(diào)節(jié)其pH，酶解一段時(shí)間后100℃水浴滅活10min，室溫下離心(4000r／min，20min)，將上清液凍干后保存。結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，當(dāng)酶解溫度低于50℃，DPPH清除率與溫度成正比，當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，DPPH清除率開(kāi)始下降。這是因?yàn)榈鞍酌笇?duì)穩(wěn)定的要求較高，溫度過(guò)低會(huì)影響酶解的反應(yīng)速度，使酶解反應(yīng)不徹底，從而影響抗氧化肽的抗氧化效果。而溫度過(guò)高則會(huì)影響蛋白酶的活性，使蛋白酶的活性降低，無(wú)法使蛋白水解成具有抗氧化性的小分子肽段，從而使DPPH清除率降低。

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