目的：探討多重耐藥銅綠假單胞菌的整合因子檢測方法及對抗生素的耐藥情況。方法：對我院2010年1月至2013年8月臨床送檢標(biāo)本中分離篩選出的50株多重耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行了回顧性分析，采用K-B紙片法檢測50株銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、慶大霉素和亞胺培南等耐藥情況；用煮沸法提取50株銅綠假單胞菌的DNA模板；同時(shí)應(yīng)用PCR技術(shù)檢測Ⅰ類整合子，通過測序分析其所攜帶的耐藥基因。結(jié)果：本組研究中，50株多重銅綠假單胞菌對以下4種藥物產(chǎn)生的耐藥率分別為環(huán)丙沙星(18%)、頭孢噻肟(32%)、亞胺培南(36%)和慶大霉素(46%)，提示銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其50株銅綠假單胞菌中Ⅰ類整合子檢出為9株，檢測陽性率為18%。Ⅰ類整合子陽性菌株多重耐藥率為85.2%，Ⅰ類整合子陰性菌株多重耐藥率為19.8%，陽性菌株多重耐藥率明顯高于陰性菌株，P＜0.05。結(jié)論：整合子是形成銅綠假單胞菌多重耐藥的重要因素，臨床要充分重視整合因子介導(dǎo)的細(xì)菌多重耐藥基因水平，從而可降低患者的感染率。

銅綠假單胞菌(PA)是臨床上較常見的病原菌，這種細(xì)菌可引起院內(nèi)感染。而整合子是一種細(xì)菌基因捕獲和表達(dá)的遺傳單位，是細(xì)菌基因中可移動(dòng)遺傳物質(zhì)，攜帶位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)組分，并可將許多耐藥基因盒整合在一起，從而形成多重耐藥。特別是Ⅰ類整合子可攜帶多種耐藥基因，這對人類的健康造成了嚴(yán)重威脅。為探討并分析多重耐藥銅綠假單胞菌的整合因子檢測方法和耐藥性，將我院臨床送檢標(biāo)本中分離篩選出的50株多重耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行了分析研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源及鑒定本研究選定我院2010年1月-2013年8月臨床送檢標(biāo)本中所分離篩選出的50株多重耐藥銅綠假單胞菌為研究對象，這些銅綠假單胞菌均為我院臨床送檢的痰液、尿液、膽汁及胸腹水等標(biāo)本中檢驗(yàn)分離出來的。病菌均采用（法國生物梅里埃公司）制造生產(chǎn)的ATB-Expression鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.2試劑與儀器本實(shí)驗(yàn)中使用的環(huán)丙沙星和頭孢噻肟購自（北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司）；慶大霉素和MH培養(yǎng)基干粉購自（杭州天和微生物試劑有限公司）；亞胺培南（編號：CTO455B）購自（英國OXOID公司）；營養(yǎng)瓊脂購自原衛(wèi)生部（上海生物制品研究所）；PCR試劑購自（中山大學(xué)達(dá)安）試劑；儀器購自（上海宏石公司）。

1.3方法①藥物敏感試驗(yàn)：K-B紙片法參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)操作規(guī)程進(jìn)行；②DNA模板制備：取0.5mL無菌管加入50μL蒸餾水，挑取少量新鮮細(xì)菌，50℃煮沸10min，8000r/min離心10min，取上清液備用；③整合子可變區(qū)擴(kuò)增：以煮沸法提取細(xì)菌總DNA作為PCR模板，PCR反應(yīng)體系為10×PCR Buffer(含Mg2＋15mmol/L)2.5μL，dNTPs2μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，兩條引物各0.5μL，模板DNA為1μL，加無菌水補(bǔ)足至25μL☆。反應(yīng)條件：93℃2min，93℃30s，55℃30s，72℃60s,30個(gè)循環(huán)；72℃60s。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀察結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)照相并保存結(jié)果。PCR產(chǎn)物片段送（上海生工生物工程有限公司）測序，測序結(jié)果與GeneBank中已知序列比對。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究結(jié)果顯示，50株多重耐藥銅綠假單胞菌對以下4種藥物的耐藥率分別為環(huán)丙沙星(18%)、頭孢噻肟(32%)、亞胺培南(36%)和慶大霉素(46%)，提示銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其50株銅綠假單胞菌中Ⅰ類整合子檢出為9株，Ⅰ類整合子檢測陽性率為18%。Ⅰ類整合子陽性菌株多重耐藥率為85.2%，Ⅰ類整合子陰性菌株多重耐藥率為19.8%，陽性菌株多重耐藥率明顯高于陰性菌株，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

有資料表明，臨床上銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，誘因也比較多，且這種病菌的耐藥性在不同的地區(qū)之間，乃至同地區(qū)、不同醫(yī)院之間引起銅綠假單胞菌耐藥的機(jī)制也不盡相同。目前隨著我國臨床抗菌藥物的廣泛使用，銅綠假單胞菌耐藥性基因的種類和數(shù)量也發(fā)生了很大的變化，并呈現(xiàn)嚴(yán)重之趨勢，尤其是臨床上出現(xiàn)的多重耐藥菌株，不僅為患者的治療造成了很大影響，同時(shí)也給醫(yī)院感染控制帶來了較大困難。因此我們臨床醫(yī)生及時(shí)了解銅綠假單胞菌耐藥基因與耐藥機(jī)制，這對臨床上合理用藥具有重要意義。

我們知道，整合子是與細(xì)菌耐藥性傳播相關(guān)的基因系統(tǒng)，是存在于細(xì)菌質(zhì)粒、染色體或轉(zhuǎn)座子上的一種遺傳結(jié)構(gòu)，可捕獲耐藥基因，使細(xì)菌表現(xiàn)為對抗生素的多重耐藥。雖然整合子相對分子質(zhì)量較小，但它能夠通過整合酶從環(huán)境中捕獲耐藥基因盒，并將耐藥基因盒組裝在一起，形成巨大的耐藥基因多基因座，同時(shí)在基因轉(zhuǎn)移和多重耐藥的形成中起主導(dǎo)作用，耐藥基因水平的高低能導(dǎo)致細(xì)菌在臨床上產(chǎn)生一定的耐藥性，且能夠加速細(xì)菌的傳播速率，若一旦新形成的耐藥基因被整合子捕獲，極有可能在細(xì)菌間廣泛播散，并且形成對新抗生素的普遍抗性，這會(huì)給臨床治療帶來很大困難。有資料顯示，Ⅰ類整合子在銅綠假單胞菌中分布廣泛，在耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制上起著重要作用，是導(dǎo)致細(xì)菌多重耐藥的關(guān)鍵。但我們從本研究的結(jié)果可以看出，分離出的50株銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、亞胺培南和慶大霉素等4種藥物有較高的耐藥率，其耐藥率分別18%、32%、36%和46%；而Ⅰ類整合子檢測陽性率為18%，整合子陽性菌株比陰性菌株多重耐藥率更高（P<0.05），證實(shí)了整合子介導(dǎo)了多重耐藥的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究對多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株攜帶的I類整合子檢測與相關(guān)耐藥性進(jìn)行了分析，以進(jìn)一步研究整合子在細(xì)菌耐藥中的作用。我們臨床醫(yī)護(hù)人員思想上應(yīng)有足夠的認(rèn)識，嚴(yán)格掌握本地區(qū)銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥性，并加大監(jiān)測力度，在臨床上要正確合理使用抗生素，以防止耐藥菌株的播散，從而減少醫(yī)院感染率的發(fā)生。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國抗生素雜志》2020年第1期，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

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