雞骨架是雞肉類加工過程中的副產(chǎn)品，是所有畜禽骨肉中蛋白質(zhì)含量最高的原料，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)16.3%，與等量雞胸肉相似。鮮雞骨架質(zhì)量占整雞質(zhì)量的比例約為20%~22%，大致由71%的雞骨，22%的雞骨肉及6%的雞皮構(gòu)成。新鮮雞骨中含有豐富的營養(yǎng)素，尤其是蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，此外鮮骨內(nèi)含有大量骨髓，主要由水分，粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和微量元素等物質(zhì)構(gòu)成"。目前，工業(yè)生產(chǎn)上對(duì)雞骨架的利用還存在利用途徑少、產(chǎn)品價(jià)值低等問題，其主要經(jīng)過粉碎烘干后作為寵物飼料.甚至直接丟棄。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，食晶加工、設(shè)備制造等技術(shù)的發(fā)展給骨類食品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展帶來了新的機(jī)遇，鮮骨加工產(chǎn)業(yè)的原料利用率和產(chǎn)品附加值有所提高，研究表明，骨蛋白酶解后釋放的氨基酸及多肽具有如下特點(diǎn)：加工性能提高，表現(xiàn)在酶解產(chǎn)物的溶解性、吸水性、保水性、乳化性.起泡性及持油性等方面鬥；功能性顯著，膠原多肽具有降血壓氣抗氧化”、促進(jìn)皮膚膠原代謝等生物活性與功能"；風(fēng)味增強(qiáng)，骨蛋白經(jīng)酶解后，具有肉的特殊鮮味與香味，可作為肉味香精的前體，通過后期的美拉德反應(yīng)可制備出各種風(fēng)味的香精調(diào)味料9。因此，探究雞骨架的深加工技術(shù)和應(yīng)用，提高其產(chǎn)品附加值，對(duì)于充分利用低值蛋白資源具有重要意義。

近年來，有不少研究探討和報(bào)道了低值畜骨的綜合利用，其主要是利用蛋白酶酶解低值蛋白，實(shí)現(xiàn)低值蛋白源的高值化。為了提高其酶解速率，一些研究者探索將部分新技術(shù)引人其中。超聲波屬于-種彈性機(jī)械波叫，其頻率范圍在2x10*-2x10*Hz之間，在介質(zhì)中傳播時(shí)，可能產(chǎn)生熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)等，其中空化作用被認(rèn)為是影響超聲波在液體介質(zhì)中反應(yīng)速度和產(chǎn)率的主要原因?？栈饔每梢鸲喾N次級(jí)效應(yīng)，如湍動(dòng)效應(yīng)、微擾效應(yīng)、聚能效應(yīng)等"，這些效應(yīng)能夠改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和特性，強(qiáng)化提取過程、加速反應(yīng)進(jìn)程。超聲波在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的氣泡經(jīng)過擠壓破裂，能在瞬間產(chǎn)生較強(qiáng)的機(jī)械剪切力，對(duì)液體介質(zhì)中的大分子產(chǎn)生機(jī)械性斷鍵作用，從而促使更多親水基團(tuán)的暴露，有利于底物與酶的結(jié)合，提高蛋白質(zhì)的水解程度0214。

作者以雞骨架為原料，采用Alealase堿性蛋白酶和Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶水解雞骨蛋白，以水解度、多肽含量等作為測試指標(biāo)，研究超聲波處理應(yīng)用于雙酶分步酶解雞骨蛋白.探討不同超聲條件對(duì)雞骨蛋白的酶解效果的影響，并針對(duì)其結(jié)果進(jìn)行機(jī)理初探。

材料與方法

1.1材料與試劑.

原料：雞骨架，超市購買，冷凍貯藏保存?zhèn)溆?。Alealse蛋白酶，F(xiàn)lavourzyme蛋白酶；諾維信公司產(chǎn)品；甲醛溶液、三氯乙酸、氫氧化鈉、硫酸銅、牛白蛋白、溴化鉀等試劑均購置于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

2-16PK型高速冷凍離心機(jī)：Sigma公司產(chǎn)品：JY98--3D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品：UV2600型紫外分光光度計(jì)：Techomap公司產(chǎn)品；FA1004型電子分析天平：上海舜寧恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)Starter3100：奧豪斯儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；8S-1型磁，力攪拌器：江蘇省金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品：SSW-420-2S型電熱恒溫水槽：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；真空冷凍干燥機(jī)：作者所在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)組裝。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1雞骨蛋白酶解液的制備方法

將雞骨架解凍后清洗除去多余的血漬，去除雞皮及油脂，用粉碎機(jī)粉碎成雞骨泥，將雞骨泥與去離子水以1：2的質(zhì)量比混合，充分?jǐn)嚢韬?，?jīng)過110ºC30min高溫高壓預(yù)處理，調(diào)節(jié)溫度和pH值，酶解總時(shí)間為3h，酶解完畢后沸水浴滅酶10min，4500r/min下離心15min，過濾除去懸浮物與碎骨渣，即得酶解液。薛解過程中采用超聲波鋪助酶解的處理方式，即酶解：雞骨蛋白的同時(shí)進(jìn)行超聲處理.超聲功率分別為200.400.600，800.1000W，超聲工作時(shí)間/間歇時(shí)間2s/2s，超聲總時(shí)間分別設(shè)置為20.40.60、80min。雙酶分步酶解的具體操作過程為：先用NaOH溶液和稀鹽酸調(diào)節(jié)雞骨泥勻漿的pH，首先調(diào)節(jié)pH值至8.5，向其中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的堿性蛋白酶，攪勻，55ºC下恒溫酶解1.5h后；再將pH值調(diào)節(jié)至7.向其中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的風(fēng)味蛋白酶，攪勻，50ºC下恒溫酶解1.5h，制得酶解液。

1.3.2水解度的測定

采用中性甲醛滴定法，即甲醛滴定出氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(具體參見國標(biāo)GB/T5009.39--2003中所述方法)，凱氏定氮法測定出總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(具體參見國標(biāo)CB5009.5--2010中所述方法)，兩者的百分比記為水解度。

1.3.3多肽質(zhì)量濃度的測定

采用雙縮脈法測定多肽含量，以牛白蛋白(BSA)作為標(biāo)樣，分別配置成0.5.1.2.3.4mg/mL的溶液，取2mLBSA溶液與3mL雙縮脲試劑均勻混合，靜置30min后，于540nm下，測定標(biāo)樣的吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中多肽質(zhì)量濃度測定時(shí)，取2mL的多肽酶解液，加人等體積的體積分?jǐn)?shù)10%三氣乙酸，均勻混合后于4ºC、4000r/min高速冷凍離心20min得到上清液，取上清液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法，測定出相應(yīng)的吸光度值，按以下公式計(jì)算多肽質(zhì)量濃度

1.3.4電子舌分析

取酶解液70ml，分別倒入電子舌專用測試杯中，使液面低于刻度線0.5-1.0mm，機(jī)器自動(dòng)測試4次，分析時(shí)取后3組實(shí)驗(yàn)的平均值，并轉(zhuǎn)化為各味覺的響應(yīng)值數(shù)值再輸出。響應(yīng)值差異越大表明差異越大，正值表明該味覺比對(duì)照組強(qiáng)，負(fù)值則相反。1.3.5.氨基酸組成測定用10g/dL.三氯乙酸等體積稀釋，放置1h，保證溶液體系中TCA終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。雙層德紙過濾后，取1mL澄清濾液于15mL.離心管內(nèi)，10000r/min下離心15min，后取400μL上清液于液相樣品瓶內(nèi)，置于氨基酸分析儀上測定。1.3.6傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析采用溴化鉀(KBr)壓片法制片后置于配有DTCS檢測器的IS10型傳里葉紅外光譜儀上進(jìn)行檢測。將酶解液凍干后磨粉，再放人瑪瑙研缽中磨為細(xì)粉，加入適量的KBr攪磨均勻，然后壓片待測。

2結(jié)果與分析

2.1超聲作用對(duì)酶解產(chǎn)物水解度及多肽含量的影響

由圖2可知，隨著超聲功率的增加，雞骨蛋白酶解液的DH及其多肽含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。超聲波功率為200-600W時(shí)，雞骨蛋白的DH有顯著提高(P<0.05)，且在600W時(shí)達(dá)到最大值，為1799%，當(dāng)超聲波功率超過600W時(shí)，雞骨蛋白的DH開始下降，1000W時(shí)下降至14.13%；而超聲功率為200-800W時(shí)，雞骨蛋白酣輝液的多肽質(zhì)量濃度呈上升趨勢，且在800w時(shí)達(dá)到最大值291mg/mL，1000w時(shí)酶解液的多肽質(zhì)量濃度下降至.2.73mg/ml。這可能是因?yàn)椋u骨蛋白的空間結(jié)構(gòu)在適當(dāng)功率的超聲波作用下會(huì)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性部位暴露出來，與酶更好的結(jié)合，此外，超聲波的振蕩作用可以使酶與底物的碰撞幾率增大，促進(jìn)二者的結(jié)合.從而提高酶解產(chǎn)物的DH。但當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，蛋白分子的活性部位、蛋白酶的分子構(gòu)象均會(huì)被損傷，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物DH的下降"。

圖3表示的是超聲處理時(shí)間對(duì)雞骨蛋白酶解產(chǎn)物特性的影響。隨著超聲時(shí)間的延長，雞骨蛋白酶解液的DH及多肽含量同樣呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢.這與超聲功率所述規(guī)律一致。當(dāng)超聲時(shí)間為30min時(shí)，DH達(dá)到24%，多肽質(zhì)量濃度達(dá)到2.14mg/mlL，此后，延長時(shí)間DH及多肽質(zhì)量濃度反而下降。這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間適宜時(shí)，超聲改變了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，加大了酶與底物的結(jié)合速率和產(chǎn)物的釋放速率嗎，從而促進(jìn)了酶解過程的進(jìn)行。然面隨著超聲時(shí)間的延長。超聲的空化作用和擾動(dòng)作用有可能使已游離的蛋白質(zhì)分子重新聚合，形成大分子物質(zhì)，底物分子構(gòu)象的改變進(jìn)而使其對(duì)酶解的促進(jìn)作用減弱。

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