枸杞（wolfberry，RW）是我國(guó)重要的藥食同源類植物資源。枸杞富含枸杞多糖、β-胡蘿卜素等多種活性成分，是珍貴的中藥材和滋補(bǔ)保健食品?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明枸杞具有保護(hù)視神經(jīng)、抗衰老、保護(hù)細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫力，降血糖和調(diào)節(jié)血脂等多種藥理功效。近年來(lái)，枸杞的抗氧化、抗衰老逐漸成為研究熱點(diǎn)。

美拉德反應(yīng)是一種非酶褐變，主要是指羰基化合物（還原糖類）和氨基化合物（氨基酸和蛋白質(zhì)）間的反應(yīng)，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的歷程最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質(zhì)類黑精。類黑精是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中主要的抗氧化成分。有研究表明，美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物（maillardreactionproducts，MRPs）不僅可改善產(chǎn)品色澤、風(fēng)味，還具有較強(qiáng)的抗氧化性。

近年來(lái)，隨著人們對(duì)養(yǎng)生保健的重視，枸杞功能性食品的研究和開(kāi)發(fā)越來(lái)越深入，特別是枸杞作為抗氧化食品的開(kāi)發(fā)，已成為枸杞加工業(yè)研究的熱點(diǎn)。美拉德反應(yīng)與枸杞結(jié)合后的褐變黑枸杞（brownblackwolfberry，BBW）抗氧化作用是否優(yōu)于紅枸杞單品，也尚未見(jiàn)報(bào)道?；诖耍驹囼?yàn)采用美拉德反應(yīng)原理，首次將枸杞與美拉德反應(yīng)結(jié)合，制備褐變黑枸杞，評(píng)價(jià)其對(duì)紫外損傷果蠅壽命及抗氧化指標(biāo)的影響，為褐變黑枸杞的抗氧化研究提供理論支持。

一、材料與方法

1、樣品

以寧夏枸杞為原料，在75%相對(duì)濕度和700C條件下放置6天，再在45⁰C的鼓風(fēng)烘箱中干燥定型。干燥風(fēng)速0.5m/s，干燥時(shí)間60min即可。得到的褐變黑枸杞在溫水中浸泡、打漿、離心、取上清液，濃縮備用。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型Oregon品系黑腹果蠅，由天津科技大學(xué)食品添加劑與功能配料研究室提供，置于光暗周期為12h、溫度為25⁰C、濕度為65%～75%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3、儀器與試劑

HWS-850智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；MR23i冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；UVmini-1240紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津儀器公司；RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化器廠；紫外燈（20W）。無(wú)水葡萄糖、瓊脂粉：分析純，天津江天化工有限公司；對(duì)羥基苯甲酸乙酯：分析純，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司，玉米粉、酵母粉：市售；過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（測(cè)分型）、考馬斯亮藍(lán)試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

4、方法

（1）果蠅培養(yǎng)基制備

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米粉72g，無(wú)水葡萄糖72g，瓊脂6g，酵母粉10g，40mL防腐劑（1%對(duì)羥基苯甲酸乙酯的75%乙醇溶液），750mL蒸餾水。
給藥培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別按照終濃度3mg/mL、12mg/mL添加相應(yīng)劑量的褐變黑枸杞和紅枸杞。

（2）壽命實(shí)驗(yàn)

收集2d齡雌、雄性果蠅各1200只，平均分為6組，每組200只，其中兩組飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中一組不照射紫外線，作為正常對(duì)照組（NC），另一組每天照射15min，作為模型對(duì)照組（MC），其余四組分別飼喂實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基即加入3mg/mL、12mg/mL的紅枸杞和褐變黑枸杞，分別命名為RL、RH、BL、BH，每天照射紫外線15min，每3天更換新培養(yǎng)基并記錄死亡數(shù)，直至果蠅全部死亡。將自然死亡的果蠅生存天數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，過(guò)度麻醉和培養(yǎng)基粘住不計(jì)算在內(nèi)。每組全部果蠅死亡天數(shù)的平均數(shù)為該組的平均壽命，各組最后20只死亡果蠅的天數(shù)平均數(shù)為該組的最高壽命，每組中半數(shù)果蠅死亡天數(shù)的平均數(shù)為半數(shù)死亡壽命。

（3）果蠅SOD、CAT、MDA含量的測(cè)定

收集2d齡雌、雄性果蠅各1200只，隨即分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、褐變黑枸杞低、高劑量組和紅枸杞低、高劑量組，每組200只。收集2d齡雌、雄性果蠅各1200只，平均分為6組，每組200只，其中兩組飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中一組不照射紫外線，作為正常對(duì)照組（NC），另一組每天照射15min，作為模型對(duì)照組（MC），其余四組分別飼喂實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基即加入3mg/mL、12mg/mL的紅枸杞和褐變黑枸杞，分別命名為RL、RH、BL、BH，每天照射紫外線15min，每3天更換新培養(yǎng)基并記錄死亡數(shù)，直至果蠅全部死亡。將自然死亡的果蠅生存天數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，過(guò)度麻醉和培養(yǎng)基粘住不計(jì)算在內(nèi)。每組全部果蠅死亡天數(shù)的平均數(shù)為該組的平均壽命，各組最后20只死亡果蠅的天數(shù)平均數(shù)為該組的最高壽命，每組中半數(shù)果蠅死亡天數(shù)的平均數(shù)為半數(shù)死亡壽命。20d后將果蠅饑餓2h后用工業(yè)氮麻醉后稱重，記錄果蠅質(zhì)量，按照1：49（mg/mL）加人已滅菌的生理鹽水在冰浴條件下勻漿，4⁰C、3500r/min離心10min后取上清液得10%果蠅勻漿液。按照試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定果蠅SOD活性（羥胺法）、CAT活性（可見(jiàn)光法）和MDA含量（TBA法）。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)處理分析，組間差異采用SPSS軟件t檢驗(yàn)，其中P＜0.05表示差異有顯著性，P＜0.01表示差異有極顯著性。

二、結(jié)果與分析

1、褐變黑枸杞對(duì)紫外損傷果蠅壽命的影響

由衛(wèi)生部頒布的《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》規(guī)定，果蠅的生存實(shí)驗(yàn)可作為延緩衰老作用的檢測(cè)方法之一。其評(píng)價(jià)指標(biāo)有平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為一個(gè)指標(biāo)的一個(gè)濃度組具有顯著性即可判定該保健品具有延緩衰老的作用。

由表1可知，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間均顯著降低（p＜0.01），說(shuō)明紫外線照射致果蠅氧化損傷模型造模成功。各劑量組與模型組相比，其平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間都有所提高。其中，與RL組相比，BH組顯著（p＜0.05）延長(zhǎng)雌、雄性果蠅平均壽命和半數(shù)死亡時(shí)間。同時(shí)，相比RL組，BH組顯著延長(zhǎng)（p＜0.05）雌性果蠅的最高壽命。說(shuō)明在該實(shí)驗(yàn)條件下，兩種枸杞對(duì)紫外損傷果蠅壽命均有延長(zhǎng)作用，但是褐變黑枸杞的延壽效果更顯著，且呈現(xiàn)一定的劑量——效應(yīng)關(guān)系。

2、褐變黑枸杞對(duì)紫外損傷果蠅體內(nèi)SOD活力的影響

由圖1可知，模型對(duì)照組的SOD活力顯著（p＜0.01）低于正常對(duì)照組，說(shuō)明每天進(jìn)行15min紫外線照射能夠加速果蠅衰老，說(shuō)明果蠅紫外損傷模型造模成功。與模型組相比，各劑量組SOD活力均有一定程度的提高，但是紅枸杞組無(wú)顯著性差異，BH組呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05）。與RL組相比，BH組SOD活力顯著提高（p＜0.05），同時(shí)，BH組相較于RH組顯著提高（p＜0.05）SOD活力。說(shuō)明在該實(shí)驗(yàn)條件下，褐變黑枸杞能夠在果蠅受到紫外線輻射后提高果蠅機(jī)體內(nèi)的SOD活力，對(duì)紫外線所造成的氧化損傷有一定的拮抗作用。
 

3、褐變黑枸杞對(duì)紫外損傷果蠅體內(nèi)CAT活力的影響

由圖2可知，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組CAT活力顯著降低（p＜0.01），說(shuō)明紫外損傷模型造模成功。與模型對(duì)照組相比，各劑量組CAT活力均有所提高，其中BH組顯著提高雌、雄果蠅CAT活力。與RL組相比，BH組能顯著抑制（p＜0.05）紫外線損傷下CAT活力的降低。

4、褐變黑枸杞對(duì)紫外損傷果蠅體內(nèi)MDA含量的影響

由圖3可知，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組MDA含量顯著性升高（p＜0.05），說(shuō)明紫外線照射能夠?qū)е鹿壯趸瘬p傷，說(shuō)明紫外損傷模型造模成功。與模型組相比，各劑量組均有一定程度的降低，其中，BH組能顯著降低（p＜0.05）雌、雄性果蠅MDA含量，RH組能顯著降低（p＜0.05）雌性果蠅MDA含量。相比較于RL組，BH組能極顯著降低（p＜0.01）雌性果蠅MDA含量。表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，褐變黑枸杞對(duì)紫外線所造成的氧化損傷有一定的拮抗作用。

三、討論

衰老的自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為，衰老過(guò)程中的退行性變化是由于細(xì)胞正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基的有害作用造成的。SOD和CAT構(gòu)成機(jī)體主要的抗氧化酶系統(tǒng)，它可清除自由基，減輕和阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化作用，保護(hù)機(jī)體免受自由基的損傷。MDA是自由基對(duì)不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫外線照射能對(duì)果蠅造成氧化損傷，能顯著縮短果蠅的壽命，降低SOD和CAT的活力，提高M(jìn)DA的含量。褐變黑枸杞對(duì)紫外損傷果蠅具有一定的保護(hù)作用，尤其是高劑量褐變黑枸杞能顯著延長(zhǎng)紫外損傷的雌雄果蠅的平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間，并呈現(xiàn)一定的劑量一效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)，與紅枸杞相比，高劑量褐變黑枸杞能顯著提高紫外損傷的雌雄果蠅SOD和CAT活力，降低MDA含量。表明褐變黑枸杞對(duì)紫外線照射導(dǎo)致的氧化損傷具有一定的保護(hù)作用，作用機(jī)理可能是通過(guò)提高SOD、CAT的活性，增強(qiáng)機(jī)體清除多余自由基的能力，減少自由基引起的生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，降低機(jī)體MDA的含量，從而起到體內(nèi)抗氧化的作用。綜上所述，褐變黑枸杞可通過(guò)清除氧自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化而延緩衰老，這為今后開(kāi)發(fā)枸杞保健食品提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

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