1 窖泥的概述

濃香型白酒是一類以泥窖固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的白酒，泥窖尤其是人工泥窖大多采用黃黏土筑窖。白酒工作者對(duì)濃香型白酒生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的高度凝練和總結(jié)———千年窖池萬(wàn)年糟，窖池越老酒越香。在一定范圍內(nèi)窖泥的質(zhì)量與濃香型大曲酒的質(zhì)量存在一定關(guān)系，即窖泥越老，大曲酒的質(zhì)量越高。窖泥中的主要功能微生物是在長(zhǎng)期的發(fā)酵過(guò)程中篩選出來(lái)的，它們的群落結(jié)構(gòu)對(duì)濃香型白酒的香味有較大的影響。窖泥微生物之間存在共生、互生及競(jìng)爭(zhēng)等多種種群關(guān)系，長(zhǎng)期的白酒生產(chǎn)使窖泥微生物的種類逐漸穩(wěn)定，同時(shí)產(chǎn)香味物質(zhì)的功能微生物數(shù)量也呈上升趨勢(shì)。目前研究發(fā)現(xiàn)新窖泥以乳桿菌為主，而老窖泥以梭菌綱、擬桿菌綱和產(chǎn)甲烷菌綱為主

2 窖泥微生物的研究技術(shù)

以往關(guān)于窖泥微生物的研究多基于純培養(yǎng)的方式，從可培養(yǎng)的角度研究微生物群落和動(dòng)態(tài)變化，分離和鑒定新型窖泥微生物，為濃香型白酒功能菌的篩選及菌種庫(kù)的建立提供依據(jù)。隨著微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)等先進(jìn)技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于窖泥微生物鑒定、群落組成解析等研究，使得對(duì)窖泥微生物認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入。

2.1 傳統(tǒng)窖泥微生物研究技術(shù)

傳統(tǒng)窖泥微生物研究方法是平板分離純化及鑒定技術(shù)，該鑒定技術(shù)包括傳統(tǒng)的菌落形態(tài)、生理生化以及對(duì)核酸序列對(duì)微生物分類。然而窖泥中能夠采用平板分離培養(yǎng)的微生物僅占窖泥微生物的一部分。目前運(yùn)用傳統(tǒng)平板僅能分離得到可培養(yǎng)的微生物，對(duì)窖泥微生物的深入研究的意義不大。已證明表現(xiàn)型相同的微生物可能是一群有相同的生理特征或形態(tài)特征的微生物，這樣是不足以明確分類的。雖然傳統(tǒng)窖泥微生物研究技術(shù)對(duì)窖泥微生物的研究存在不足，但厭氧培養(yǎng)、純培養(yǎng)技術(shù)和傳統(tǒng)的微生物鑒定技術(shù)為白酒生產(chǎn)起到了重要的推動(dòng)作用。從濃香型窖泥中分離純化得到5株細(xì)菌，并用傳統(tǒng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定了其中一株細(xì)菌。應(yīng)用傳統(tǒng)微生物分離方法從濃香型窖泥中分離研究了窖泥微生物的生理特性。通過(guò)對(duì)瀘州老窖酒廠不同窖齡窖泥中5大功能菌群的數(shù)量和生態(tài)結(jié)構(gòu)研究，發(fā)現(xiàn)窖泥功能微生物的數(shù)量隨窖齡增加而增加。以純培養(yǎng)方法對(duì)窖泥中的微生物研究由來(lái)已久。傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)在窖泥研究中仍被廣泛使用，這主要是由于該技術(shù)可以研究特定微生物的理化特征，分離得到的功能微生物可應(yīng)用于白酒生產(chǎn)。

2.2 現(xiàn)代窖泥微生物研究技術(shù)

隨著微生物研究技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于窖泥微生物鑒定、群落組成解析等研究?，F(xiàn)代分子生物技術(shù)具有不需培養(yǎng)、快速準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，對(duì)窖泥微生物的研究更加深入，現(xiàn)代分子生物技術(shù)可將窖泥微生物在種屬水平上進(jìn)行系統(tǒng)分析，對(duì)泥的實(shí)際生產(chǎn)和養(yǎng)護(hù)不僅可以提供理論指導(dǎo)，還能解決窖泥退化和老化問(wèn)題。

2.2.1 磷脂脂肪酸指紋圖譜技術(shù)在窖泥微生物研究中的應(yīng)用

磷脂是大多數(shù)微生物（古生菌除外）細(xì)胞膜中相對(duì)穩(wěn)定的成分，且含量相對(duì)比較穩(wěn)定，只有微生物死亡后，磷酯類化合物才會(huì)迅速分解。不同種類的微生物細(xì)胞膜上的磷脂脂肪酸組成及含量存在顯著差異，即特定的特征脂肪酸僅存在特定的微生物中。如：脂肪酸15∶0，a15∶0，i15∶0，10Me18∶0 等用來(lái)表征放線菌。磷脂脂肪酸技術(shù)不需要酸15∶0，17∶0，18∶1ω7 等用來(lái)表征細(xì)菌；脂肪酸16∶0，18∶2ω6等用來(lái)表征真菌；不分離培養(yǎng)即可獲得微生物群落信息，適合微生物群落的研究。該技術(shù)主要是提取脂肪酸結(jié)合常見微生物的磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)和利用氣相色譜即可完成對(duì)微生物的鑒定，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果較為可靠，能定量描述環(huán)境樣品中的微生物群體。近年來(lái)，磷脂脂肪酸技術(shù)在窖泥微生物的研究中得到廣泛應(yīng)用。PLFA指紋圖譜技術(shù)分析法可簡(jiǎn)單歸納為：（1）提取磷脂脂肪酸；（2）氣相色譜分析，獲得PLFA譜圖；（3）通過(guò)譜圖的變化得到微生物結(jié)構(gòu)變化情況。采用磷脂脂肪酸指紋圖譜技術(shù)對(duì)窖泥微生物進(jìn)行了研究，結(jié)果表明厭氧細(xì)菌和真菌是窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌群。采用磷脂脂肪酸指紋圖譜技術(shù)研究30年、100年的窖泥發(fā)現(xiàn)，100年窖齡的窖泥微生物比30年窖齡的豐富，細(xì)菌是窖泥的優(yōu)勢(shì)菌群。

2.2.2 克隆文庫(kù)技術(shù)在在窖泥微生物研究中的應(yīng)用

克隆文庫(kù)是通過(guò)獲得窖泥樣品總脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA），以提取到的總DNA為模板聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增微生物的16S rDNA基因，然后將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果判斷樣品中的微生物信息，由于克隆文庫(kù)針對(duì)原核微生物的16S rDNA全長(zhǎng)，且避開了傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法，能將一些對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻的微生物鑒定出來(lái)，因此能更全面的反映樣品中的微生物多樣性；由于采用該方法能獲取微生物的16S rDNA全序列，所以結(jié)果也更加準(zhǔn)確。以克隆文庫(kù)技術(shù)對(duì)不同窖齡窖泥古菌進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，通過(guò)16S rDNA克隆文庫(kù)技術(shù)能夠系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)了不同窖齡窖泥細(xì)菌群落的基本構(gòu)成及演替規(guī)律。窖泥微生物在50年前后變化明顯，50年之前窖泥中古菌種群結(jié)構(gòu)變化較大；50年之后，古菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。以克隆文庫(kù)技術(shù)對(duì)瀘州地區(qū)濃香型窖泥原核微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，梭菌綱為窖泥內(nèi)細(xì)菌群落的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群，除此之外還存在一定比例的芽孢桿菌綱、擬桿菌門、柔膜菌門和互養(yǎng)菌門的分布。此外該研究還首次發(fā)現(xiàn)在瀘州老窖窖泥內(nèi)可能存在與甲烷菌共生的嚴(yán)格厭氧的梭菌綱類群的存在。盡管通過(guò)克隆文庫(kù)法對(duì)窖泥的研究取得了一些成果，但該技術(shù)仍有不足，如操作繁
瑣，且耗時(shí)耗力等。

2.2.3 PCR-DGGE技術(shù)在窖泥微生物研究中的應(yīng)用

變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)最初用于檢測(cè)DNA中的點(diǎn)突變，后來(lái)逐漸用于環(huán)境微生物多樣性的分析，如活性污泥、海洋、土壤等方面的微生物群落研究]。溫度、pH等外界因素可以使DNA分子由雙鏈變性為單鏈。聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)原理是利用不同DNA分子解鏈難易程度以及在聚丙烯酰胺電泳中遷移受分子質(zhì)量和電荷的影響程度不同而實(shí)現(xiàn)分離。該技術(shù)無(wú)需培養(yǎng)、直接提取總DNA分析的微生物多樣性具有簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確，在白酒微生物的研究中起著重要作用。采用PCRDGGE技術(shù)及測(cè)序技術(shù)研究了不同窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化趨勢(shì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)窖齡越長(zhǎng)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)研究了不同窖齡窖泥中主要微生物群落結(jié)構(gòu)與窖泥理化指標(biāo)之間的關(guān)系。

研究結(jié)果表明窖泥的理化指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)變化有極大相關(guān)性。應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)分析了不同性狀窖泥的細(xì)菌群落，結(jié)果表明，窖泥中優(yōu)勢(shì)微生物包含擬桿菌門、放線菌門、變形菌門和厚壁菌門4個(gè)門類，其中新窖泥中微生物最豐富，涵蓋上述門類，假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌（Enterobacterale），里氏桿菌屬（Riemerella）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）為新窖泥特有的優(yōu)勢(shì)微生物。雖 然PCR- DGGE具有免培養(yǎng)，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，是白酒窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)的主要研究方法之一，但對(duì)一些數(shù)量低的窖泥微生物不能有效地檢測(cè)出。由于PCR-DGGE技術(shù)的優(yōu)勢(shì)明顯，在白酒窖泥微生物群落的研究中有著重要影響，隨著技術(shù)的發(fā)展，PCR-DGGE技術(shù)會(huì)不斷優(yōu)化，與其他現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合，揭示窖泥微生物的“秘密”。

3 結(jié)論與展望

在濃香型大曲白酒固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中逐漸形成了復(fù)雜的窖泥微生物群落，微生物菌群相互作用和獨(dú)特的生產(chǎn)工藝形成了濃香型大曲白酒窖香濃郁、綿甜爽烈的風(fēng)格特征。由于窖泥中的釀酒微生物群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，以及部分微生物難于分離培養(yǎng)，使得對(duì)窖泥微生物的研究提出了更高的要求。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)在窖泥中的應(yīng)用，對(duì)窖泥微生物的研究越來(lái)越深入。主要集中在窖泥微生物群落多樣性和窖泥微生物群落的演替及窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)與窖泥質(zhì)量關(guān)系等方面的研究。運(yùn)用現(xiàn)代化的儀器設(shè)備和現(xiàn)代分子生物技術(shù)（克隆文庫(kù)、DGGE、測(cè)序技術(shù)等）揭開了窖泥微生物的部分面紗：窖泥中的微生物種類與窖泥的質(zhì)量關(guān)系極大，老熟窖泥中的優(yōu)勢(shì)微生物有擬桿菌門、放線菌門、變形菌門和厚壁菌門等4個(gè)門類，其中放線菌可以作為一種判斷窖泥老熟與老化的指示菌。雖然現(xiàn)代分子生物技術(shù)已大量應(yīng)用于窖泥微生物的研究，但是傳統(tǒng)微生物學(xué)技術(shù)對(duì)窖泥微生物的研究仍占有重要的地位。總之，要完全認(rèn)識(shí)窖泥微生物還存在較多技術(shù)瓶頸和壁壘。為進(jìn)一步掌握白酒窖泥微生物與窖泥質(zhì)量以及在代謝上的關(guān)系，宏基因組學(xué)、微生物代謝組學(xué)等現(xiàn)代分子生物技術(shù)將有助于加深對(duì)窖泥微生物代謝活動(dòng)的認(rèn)識(shí)和了解窖泥微生物群落代謝機(jī)制，有助于解決白酒生產(chǎn)中遇到的實(shí)際問(wèn)題，以便生產(chǎn)更多優(yōu)質(zhì)的濃香型大曲白酒。

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