骨質(zhì)疏松癥是一種常見的代謝性骨病。世界衛(wèi)生組織在2015年提出的《關(guān)于老齡化與健康的全球報(bào)告》指出，在國家和全球?qū)用嫔闲枰匦潞统掷m(xù)關(guān)注改善肌肉骨骼健康。骨重建過程取決于維持成骨細(xì)胞形成骨基質(zhì)與破骨細(xì)胞消除骨礦化之間的平衡。成骨細(xì)胞響應(yīng)骨細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)，并將破骨細(xì)胞前體募集到重塑部位，然后，通過骨保護(hù)素（OPG）/核因子κB配體受體激活劑（RANKL）/核因子κB受體激活劑（RANK）系統(tǒng)的受體激活劑，成骨細(xì)胞可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成。

骨質(zhì)疏松癥主要是體內(nèi)維生素D缺乏，鈣攝入量不足以及雌激素下降引起的。目前，人們普遍接受雌激素替代療法用于治療因缺乏雌激素的骨質(zhì)疏松癥患者。然而其有副作用，尤其是增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。維生素D3（VitaminD₃，VD₃）是骨形成系統(tǒng)中的重要參與者，在鈣穩(wěn)態(tài)中具有增加鈣從腸道吸收的功能。飲食中攝入足夠的維生素D3是必要的，其廣泛存在于油性魚和鱈魚肝油中。染料木素（Genistein，Gen）是常見的異黃酮植物雌激素化合物之一，在大豆中的含量豐富，也是可食用的天然物質(zhì)，能夠有效降低副作用。

目前已有大量從細(xì)胞及動(dòng)物水平上研究關(guān)于維生素D₃或者染料木素對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響。維生素D₃及染料木素在促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化過程中存在協(xié)同作用，協(xié)同誘導(dǎo)成骨細(xì)胞活化并阻止破骨細(xì)胞的分化。適當(dāng)劑量的染料木素與鈣和維生素D₃結(jié)合被視為預(yù)防和管理骨質(zhì)流失的一種新的潛在療法。

本文在細(xì)胞水平上驗(yàn)證維生素D₃和染料木素對(duì)治療骨質(zhì)疏松癥的協(xié)同作用，并研究維生素D₃和染料木素在破骨細(xì)胞形成中的作用，為通過維生素D₃治療骨質(zhì)疏松癥提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7、人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63，均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

DMEM培養(yǎng)基（無酚紅）、Trizol試劑、胰蛋白酶，上海生工生物有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液，碧云天生物技術(shù)；染料木素、維生素D₃，維克奇生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma-Aldrich公司；抗壞血酸、茜素紅S染色液（1%，pH4.2）、西吡氯銨（CPC）、β-甘油磷酸鈉，北京索萊寶科技有限公司；核因子κB受體活化因子（RANKL），美國ROCKLAND公司；胎牛血清（FBS），NQBB；抗酒石酸酸性磷酸酶染液、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒，南京建成生物工程研究所；噻唑藍(lán)（MTT）、瓊脂糖，美國Invitrogen有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene公司；IX71熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Flash全波長掃描熒光酶標(biāo)儀、7500RealTimePCRSys-tem，美國賽默飛公司；垂直層流潔凈工作臺(tái)，上海凈化設(shè)備有限公司；Heracell150二氧化碳培養(yǎng)箱、BiofugeStratos冷凍離心機(jī)，美國賽默飛公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7均在5%CO₂、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基使用含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的無酚紅DMEM培養(yǎng)基。

1.3.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖

取生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63或者小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，以每孔5×10³個(gè)接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，給藥組分別加入不同濃度的染料木素、維生素D₃，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基。藥物作用一定時(shí)間后吸除96孔板中的培養(yǎng)基，在37℃環(huán)境下，每孔用100μLMTT溶液（0.5mg/mL）孵育4h。小心吸除孵育后的MTT溶液，每孔用100μLDMSO溶解紫色結(jié)晶甲瓚，輕柔混勻。使用酶標(biāo)儀以630nm波長處的A值作為參照，檢測(cè)570nm波長處的吸光度A值。

1.3.3 堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)定

人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63以每孔2×10⁵個(gè)接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，給藥組添加不同濃度的藥物，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基培養(yǎng)一定時(shí)間。檢測(cè)時(shí)用PBS洗2遍，每孔加入150μL的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，置冰上30min后，4℃下離心15min，轉(zhuǎn)速為14000r/min，吸取上清液置于冰上，測(cè)定ALP活性嚴(yán)格按照ALP試劑盒說明書操作，檢測(cè)波長520nm。

1.3.4 茜素紅染色鑒定骨礦化

人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63以每孔2×10⁵個(gè)接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，礦化組和給藥組均換用含50μmol/L抗壞血酸和10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，給藥操作同1.3.3節(jié)。每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，每1～2d更換培養(yǎng)基1次。21d后在倒置顯微鏡下觀察，部分細(xì)胞成片積累生長，出現(xiàn)形狀各異的“黑斑”，即為礦化結(jié)節(jié)。PBS清洗細(xì)胞2遍晾干，95%乙醇固定10min，蒸餾水清洗后晾干。加入茜素紅S染色液（1%，pH4.2），37℃染色60min。蒸餾水清洗2～3遍將未結(jié)合的染料洗掉，動(dòng)作輕柔避免洗掉細(xì)胞，晾干后倒置顯微鏡下拍照并記錄。每孔加1mL10%CPC溶液充分溶解深紅色化合物，測(cè)定其在550nm下A值，鈣結(jié)節(jié)的量與A值的大小成正比，以定量鈣沉積情況。

1.3.5 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，以1×10⁴/孔接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入含50ng/mLRANKL誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成。誘導(dǎo)6d后在倒置顯微鏡下可觀察到有多核細(xì)胞的形成，根據(jù)抗酒石酸酸性磷酸酶染液說明進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察拍照。記錄到含有大于3個(gè)細(xì)胞核的TRAP陽性多核細(xì)胞為破骨細(xì)胞。

1.3.6 破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性檢測(cè)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7以每孔5×10³個(gè)接種于6孔板中，每孔2.5mL。細(xì)胞貼壁后，給藥組和對(duì)照組均用含RANKL誘導(dǎo)劑（50ng/mL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，給藥組加入不同濃度的不同藥物。每1～2d更換培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)6d。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，PBS洗1～2遍，每孔加入150μL的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，置冰上30min后，在4℃下離心15min，轉(zhuǎn)速為14000r/min，取上清液為總蛋白置于冰上，測(cè)定TRAP活性嚴(yán)格按照TRAP試劑盒說明書操作，檢測(cè)波長530nm。

1.3.7 人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63的RNA提取及RT-PCR

MG-63細(xì)胞以每孔1×10⁵個(gè)接種于6cm培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后加入藥物（分組及給藥情況同1.3.3節(jié)）。培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。用Trizol提取總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：采用兩步PCR反應(yīng)程序法，第一步預(yù)變性95℃、30s；第二步PCR反應(yīng)，95℃、5s，60℃、34s，循環(huán)40次。目的基因mRNA水平以與參照基因GAPDH的Tm比值表示。PCR引物序列如表1所示。

1.3.8 破骨細(xì)胞的RNA提取及RT-PCR參照1.3.6節(jié)方法處理細(xì)胞

細(xì)胞提取RNA及RT-PCR方法同1.3.7節(jié)。

1.3.9 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)為x-±s表示，n≥3，使用鄧肯字母標(biāo)記法標(biāo)記多重比較，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差的T檢驗(yàn)分析。P＜0.05差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

相關(guān)鏈接：二甲基亞砜，胰蛋白酶，抗壞血酸，西吡氯銨

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