1、利用農(nóng)藥分子的原有基因合成：利用--農(nóng)藥分子中原有的活性基團(tuán)，或經(jīng)適當(dāng)化學(xué)反應(yīng)在農(nóng)藥分子上形成-C1、-COCl、-OH、-NH₂、-CHO等活性基團(tuán)，然后再與適當(dāng)試劑縮合，如氨基酸與酰鹵或醛基、酸酐與羥基反應(yīng)等，從而合成含適當(dāng)長(zhǎng)度“連接臂”的農(nóng)藥半抗原。比如可在堿性條件下將噻菌靈分子中的氨基與溴代丙酸縮合，合成噻菌靈半抗原。

2、利用合成農(nóng)藥的中間體或農(nóng)藥的降解產(chǎn)物(或結(jié)構(gòu)類似物)合成：如克百威半抗原的合成，先用呋喃酚和光氣反應(yīng)生成2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋哺基氯甲酸酯，然后再和4-氨基丁酸或6氨基己酸反應(yīng)得到保持克百威結(jié)構(gòu)特征、具有羧基末端、含4個(gè)碳原子或6個(gè)碳原子“連接臂”的克百威半抗原。

3、從頭合成：如三唑磷半抗原的合成，以三氯硫磷為起始原料，先與乙醇反應(yīng)生成二氯硫代磷酸乙酯，再先后與苯唑醇、氨基己酸(或氨基丁酸)反應(yīng)得到三唑磷半抗原N-[(O-乙基-O-苯基-1，2，4-三唑)硫代磷?；鵠-6-氨基己酸(或丁酸)。

(二)農(nóng)藥人工抗原(免疫原和包被原)的制備

農(nóng)藥人工抗原的制備是指將農(nóng)藥半抗原與載體蛋白共價(jià)耦聯(lián)的過程。制備人工抗原時(shí)應(yīng)充分將農(nóng)藥的特征結(jié)構(gòu)突出于載體蛋白表面。根據(jù)農(nóng)藥半抗原中活性基團(tuán)的不同，可采用不同的方法與載體蛋白共價(jià)耦聯(lián)。對(duì)于含活性羧基的農(nóng)藥半抗原，通常采用活性酯法、碳二亞胺法或混合酸酐法與載體蛋白的游離氨基形成酰胺鍵而共價(jià)耦聯(lián)。對(duì)于含脂肪族伯氨的農(nóng)藥，通常通過戊二醛、二異氰酸酯、亞胺酸酯等連接劑與載體蛋白質(zhì)共價(jià)耦聯(lián)。對(duì)于含芳香族伯胺(芳香族硝基可先還原為氨基)的農(nóng)藥，可先反應(yīng)生成重氮鹽，再與載體蛋白分子中酪氨酸殘基上酚羥基的鄰位形成偶氮鍵而共價(jià)耦聯(lián)。對(duì)于含羥基、氨基的農(nóng)藥，可先與琥珀酸酐、氯乙酸鈉反應(yīng)引入游離羧基，再與載體蛋白質(zhì)耦聯(lián)，對(duì)于含糖基的物質(zhì)，分子中的鄰二醇可被過碘酸鹽氧化為醛基，再與載體蛋白質(zhì)的游離氨基形成酰胺鍵而共價(jià)耦聯(lián)。在制備人工抗原時(shí)，用于制備免疫原的載體蛋白和用于制備包被原的載體蛋白通常來自不同種屬，這樣可以在農(nóng)藥免疫分析中減少抗體與蛋白質(zhì)的非特異性反應(yīng)。

(三)抗體的制備與純化

1、多克隆抗體的制備多克隆抗體的制備用人工合成的免疫原免疫兔、羊等健康動(dòng)物。

由于細(xì)菌、病毒等顆粒性抗原的免疫原性比人工抗原的免疫原性強(qiáng)，所以在用人工抗原免疫被細(xì)菌、病毒等病原物或寄生蟲感染的動(dòng)物時(shí)，難以獲得對(duì)目標(biāo)分析農(nóng)藥具特異性親和力的抗體。

動(dòng)物免疫方案：首次免疫以弗氏完全佐劑乳化免疫原使成油包水乳劑，用于皮內(nèi)多點(diǎn)注射；加強(qiáng)免疫以弗氏不完全佐劑乳化免疫原使成油包水乳劑，用于皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射。免疫部位包括背部皮內(nèi)和皮下、頸部皮下、腹腔、腳掌、腹股溝淋巴結(jié)等。未經(jīng)佐劑乳化的水溶性免疫原，可進(jìn)行肌肉注射或靜脈注射。按免疫劑量，動(dòng)物免疫分微量法、常量法和大量法。微量法的免疫原劑量在微克(μg)級(jí)，常量法多為1～2mg/kg(體重)，大量法的免疫劑量為50～100mg/kg每只動(dòng)物；首次免疫的間隔時(shí)間一般3周左右，以后每隔7～10d加強(qiáng)免疫1次。4免后1周開始耳緣靜脈采血，室溫自然凝固后4℃放置過夜，分離血清。將抗血清按1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64……稀釋，瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)定抗血清效價(jià)達(dá)1∶64時(shí)，頸動(dòng)脈采全血，室溫自然凝固后4℃放置過夜。次日分離血清，加0.02％疊氮化鈉于一20℃分管凍存，可保存3～5年。也可采用硫酸銨三步鹽析法分離抗血清中的免疫球蛋白，必要時(shí)用免疫蛋白A或免疫蛋白G微球、離子交換柱色譜以及二乙胺乙基(DEAE)纖維素吸附法進(jìn)一步純化，凍干。抗體凍干粉于-20℃可保存5～10年。

2、單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備采用雜交瘤技術(shù)，具體步驟如下。

(1)動(dòng)物免疫：用純化抗原對(duì)8～12周齡的BALB/c健康小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫(水溶性抗原需先用弗氏完全佐劑充分乳化)。通常共免疫5～8次，免疫問隔時(shí)問為2～3周。檢查抗血清的效價(jià)，末次免疫后3～4d，分離脾細(xì)胞。

(2)骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)：取Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞株，先用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基做適應(yīng)培養(yǎng)，細(xì)胞倍增時(shí)間一般為10～15h，最高生長(zhǎng)密度為9.0×10⁵個(gè)/mL。在細(xì)胞融合前1d，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2.0×10⁵個(gè)/mL，次日一般為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

(3)細(xì)胞融合：取具有高活性的骨髓瘤細(xì)胞和睥細(xì)胞按適當(dāng)比例(一般1∶4)混合，加入聚乙二醇(PEG)使細(xì)胞彼此融合，然后用培養(yǎng)液稀釋以消除聚乙二醇的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋后置培養(yǎng)板中培養(yǎng)。

(4)篩選：細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋l0％～20％培養(yǎng)板的孔底時(shí)，吸取上清液用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)抗體含量，篩選出抗體含量高的分泌孔。將孔中細(xì)胞再克隆化，而后用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法進(jìn)行抗原特異性測(cè)定，選出分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，液氮罐中凍存。

參考資料：農(nóng)藥殘留分析，如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系。

相關(guān)鏈接：噻菌靈，苯唑醇，離子交換柱，乙二醇