3、兩種甜葉菊廢渣提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝臟組織抗氧化指標(biāo)的影響

各組小鼠肝臟中抗氧化指標(biāo)如圖3所示。與正常組相比，D-半乳糖組小鼠肝臟組織中SOD和GPx活力顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），表明經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)，小鼠肝臟組織中抗氧化活性顯著下降，脂質(zhì)過(guò)氧化物顯著增多。與D-半乳糖組相比，樣品1的低、中、高劑量組小鼠肝臟組織中SOD和GPx活力均顯著增加，MDA含量顯著下降，其中高劑量組SOD和GPx活力分別增加了96.51%和122.52%（P＜0.05），MDA含量降低38.2%（P＜0.05）；樣品2的低、中、高劑量組小鼠肝臟組織中SOD和GPx活力較D-半乳糖組均顯著增加，其中高劑量組SOD和GPx活力分別增加了192.06%和189.83%（P＜0.05），樣品2的低、中劑量組小鼠肝臟內(nèi)MDA與D-半乳糖組之間無(wú)顯著性差異，而高劑量組MDA含量較D-半乳糖組顯著降低了34.1%（P＜0.05）。兩種甜葉菊廢渣提取物之間相比，對(duì)D-半乳糖處理小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)（SOD，GPx和MDA）的影響無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。綜合以上結(jié)果表明，兩種甜葉菊廢渣提取物均具有提高D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠肝臟中抗氧酶活力和清除肝臟中自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的能力，具有緩解肝臟氧化應(yīng)激損傷的效果。
 

4、兩種甜葉菊廢渣提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織抗氧化指標(biāo)的影響

甜葉菊廢渣提取物對(duì)小鼠腦組織中SOD，GPx和MDA的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。與正常組相比，D-半乳糖組小鼠腦組織內(nèi)SOD和GPx活力顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著增加（P＜0.05），表明經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)，小鼠腦組織內(nèi)抗氧化酶活性顯著下降，脂質(zhì)過(guò)氧化物顯著增多，模型構(gòu)建成功。兩種甜葉菊廢渣提取物低劑量組小鼠腦組織內(nèi)SOD和GPx活力，MDA含量與D-半乳糖組相比均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；兩種甜葉菊廢渣提取物中劑量組小鼠腦組織內(nèi)SOD活力較D-半乳糖組分別顯著增加了66.87%和62.16%（P＜0.05），GPx活力無(wú)顯著性差異（P＞0.05），樣品1中劑量組小鼠腦組織內(nèi)MDA含量較D-半乳糖組顯著下降了39.10%（P＜0.05），而樣品2中劑量組小鼠腦組織內(nèi)MDA含量與D-半乳糖組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與D-半乳糖組相比，樣品1高劑量組小鼠腦組織內(nèi)SOD和GPx活力分別顯著增加了73.85%和19.56%（P＜0.05），MDA含量與D-半乳糖組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），樣品2高劑量組小鼠腦組織內(nèi)SOD和GPx活力較D-半乳糖組分別顯著增加了73.48%和24.71%（P＜0.05），MDA含量顯著下降了38.46%（P＜0.05）。兩種甜葉菊廢渣提取物之間相比，對(duì)D-半乳糖處理小鼠腦組織抗氧化指標(biāo)（SOD，GPx和MDA）的影響無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。綜合以上結(jié)果表明，兩種甜葉菊廢渣提取物均具有提高D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠腦組織中抗氧酶活力和清除腦組織中自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的能力，有效防止或緩解腦組織中自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，從而起到抗氧化的作用。

5、兩種甜葉菊廢渣提取物對(duì)小鼠腦組織GPx1，SOD1，HO-1和Nrf-2的mRNA表達(dá)水平的影響

綜合以上結(jié)果可知，兩種甜葉菊廢渣提取物高劑量組對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷抑制作用效果優(yōu)于低劑量和中劑量組，因此選擇高劑量組研究甜葉菊廢渣提取物對(duì)D-半乳糖處理小鼠腦組織中抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)水平。如圖5所示，與正常組相比，D-半乳糖處理可顯著降低小鼠肝臟組織中GPx1，SOD1，HO-1和Nrf-2基因相對(duì)表達(dá)水平（P＜0.05）。與D-半乳糖組相比，樣品1高劑量組GPx1，SOD1，HO-1和Nrf-2基因相對(duì)表達(dá)水平分別顯著提高了37.55%，68.95%，94.53%和58.74%（P＜0.05）；樣品2高劑量組GPx1，SOD1，HO-1和Nrf-2基因相對(duì)表達(dá)水平分別顯著提高了39.79%，60.21%，98.16%和58.01%（P＜0.05）。兩種甜葉菊廢渣提取物之間相比，對(duì)D-半乳糖處理小鼠腦組織抗氧化基因的相對(duì)表達(dá)（GPx1，SOD1，HO-1和Nrf-2）水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。綜合以上結(jié)果表明，兩種甜葉菊廢渣提取物高劑量組均能激活D-半乳糖處理小鼠體腦組織內(nèi)抗氧化基因的表達(dá)，增強(qiáng)其體內(nèi)抗氧化活性。

三、討論

Barroso等通過(guò)HPLC-DAD-ESI/MS對(duì)兩種貯存條件下的甜葉菊提取物成分進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其含有18種酚酸和黃酮類化合物，其中含量最高的為綠原酸和異綠原酸A。本研究鑒定的兩種甜葉菊廢渣提取物中的主要成分為咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素和槲皮苷，均包含在Barroso等報(bào)道的18種酚酸和黃酮化合物之中，其中含量最高的為咖啡酸、異綠原酸C和異綠原酸B，Barroso等研究的甜葉菊提取物是從甜葉菊葉片中提取得到，而本研究使用的甜葉菊廢渣提取物是從甜菊糖苷生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的絮凝廢渣中提取得到，因此兩者主要成分之間存在差異Shukla等和Tadhani等研究表明甜葉菊提取物具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，能抑制一系列自由基，如DPPH、羥自由基、一氧化氮等。另外，有研究顯示槲皮素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，其體外抗氧化作用與維生素C和維生素E作用相當(dāng)，同時(shí)槲皮素還可以提高二甲基亞砜誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)總抗氧化能力，綠原酸和咖啡酸可以增強(qiáng)腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的抗氧化能力。

本研究鑒定的兩種甜葉菊廢渣提取物均含有這些已報(bào)道的具有抗氧化作用的成分，因此甜葉菊廢渣提取物具有提高機(jī)體抗氧酶活力，清除自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的能力，可有效防止或緩解自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。

D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型最早在1985年，由徐敝本在使用嚙齒動(dòng)物衰老模型進(jìn)行延緩衰老藥物的研究中提出。D-半乳糖的作用機(jī)制與氧化應(yīng)激損傷，鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，線粒體老化，非酶糖基化反應(yīng)，端粒短縮及端粒酶的活性下降，以及免疫功能減退有關(guān)。D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型與其它衰老模型相比，與自然衰老最為相近，成模簡(jiǎn)易，結(jié)果穩(wěn)定，因此得到較廣泛推廣應(yīng)用。本試驗(yàn)中，小鼠經(jīng)頸部皮下注射D-半乳糖11周之后，肝臟、腦和血清中SOD和GPx活性均顯著降低，MDA含量顯著升高，抗氧化酶基因表達(dá)量顯著下降，這與高璐等和Lei等的結(jié)論一致，表明衰老模型構(gòu)建成功。

酶促反應(yīng)系統(tǒng)被認(rèn)為是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，具有清除自由基，催化細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物分解等作用，防止氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體造成的傷害，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，主要由一些酶組成，如SOD，GPx等，非酶促反應(yīng)體系主要為維生素、氨基酸和金屬蛋白質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，與D-半乳糖組小鼠相比，兩種甜葉菊廢渣提取物高劑量組小鼠體內(nèi)SOD，GPx活性顯著增加，MDA含量顯著降低，抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)增加，這與符莎露等報(bào)道植物多酚對(duì)衰老小鼠抗氧化作用研究結(jié)果一致，表明甜葉菊廢渣提取物具有良好的抗氧化、防衰老作用。Nrf-2在抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄中起著重要作用，是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因如HO-1，SOD和GPx等基因的表達(dá)，從而提高抗氧化酶的活性。文獻(xiàn)報(bào)道一些天然化合物，如槲皮素、綠原酸等，可通過(guò)激活Nrf-2，增加HO-1等抗氧活性酶的mRNA表達(dá)，本試驗(yàn)中的甜葉菊廢渣提取物高劑量組富含多酚黃酮類化合物，能提高抗氧化基因GPx1，SOD1，HO-1和Nrf2的表達(dá)，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。Jeong等研究表明，植物多酚類可以通過(guò)激活D-半乳糖模型小鼠體內(nèi)PI3K/Akt/Nrf2信號(hào)通路，緩解體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，因此甜葉菊廢渣提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化機(jī)制可能與激活小鼠體內(nèi)PI3K/Akt/Nrf2信號(hào)通路，提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物質(zhì)的生成有關(guān)，對(duì)其抗氧化作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究具有重要意義。

四、結(jié)論

兩種甜葉菊廢渣提取物富含酚酸和黃酮類化合物，能提高衰老模型小鼠血清、肝臟、腦組織SOD和GPx活力，降低MDA含量，增強(qiáng)抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)，說(shuō)明兩種甜葉菊廢渣提取物均能有效緩解D-半乳糖對(duì)小鼠造成的氧化應(yīng)激損傷。因此，甜葉菊廢渣提取物具有良好的體內(nèi)抗氧化作用，為今后甜葉菊廢渣提取物相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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