鰱魚（Silvercarp，Hypophthalmichthysmolitrix），脊索動物門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、鰱屬，是著名的四大家魚之一，產(chǎn)量僅次于草魚，2019年年產(chǎn)值381.03萬t。鰱魚中含有豐富的優(yōu)質蛋白質和多種不飽和脂肪酸，包括8種必需氨基酸和組氨酸，其中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的含量達到海水魚標準；鰱魚中還含有鉀、鈉、鈣、鎂、磷等常量元素以及鋅、硒、鐵等微量元素。其肉薄刺多，土腥味較重，市場上主要以活體的銷售為主，部分鰱魚被加工成凍品魚片、魚粉制品及魚丸，使用率不高，還造成很多的垃圾，破壞環(huán)境，資源浪費嚴重，消費者接受程度低于其它水產(chǎn)品。通過加工成魚糜制品，可提高其經(jīng)濟價值。

魚糜制品在凍藏過程中易腐敗變質。其腐敗機制涉及生物、化學、物理等變化，其中，微生物是引起腐敗的主要因素，特別是新鮮和冷凍食品，由于未經(jīng)過高溫處理或其它處理方式消毒，附著在食品中的微生物生長繁殖，最終導致食品腐敗變質。Lücking等對369種腐敗的食品樣品的研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌占主導地位，還檢測到少數(shù)的海水芽胞八疊球菌，同時證明地衣芽胞桿菌具有一定的蛋白水解酶活性，能夠分解利用蛋白質。本團隊以往的研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌是造成鰱魚糜制品腐敗的優(yōu)勢腐敗菌之一。1945年，瑞士Rose等在地衣芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶，它是一類在堿性條件下能夠水解蛋白質肽鍵的酶類。趙巧靈利用差異蛋白質組學技術研究金槍魚在冷藏過程中的品質變化，魚肉組織蛋白酶加速肌原纖維結構蛋白質降解過程，破壞魚肉組織結構，導致魚肉品質下降。

本試驗中，利用差異蛋白質組學技術研究地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶對鰱魚肌原纖維蛋白的降解作用，尋找降解過程中的肌原纖維蛋白差異蛋白點，并利用GO功能注釋及KEEG通路分析鰱魚肌原纖維蛋白微生物降解的途徑，為今后鰱魚等水產(chǎn)品的微生物腐敗研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

活鰱魚購于遼寧省錦州市林西路水產(chǎn)市場，1h內運送至實驗室，立即冰水致死。固相pH值梯度（immobilizedpHgradient，IPG）預制干膠條（pH4～7，17cm）、載體兩性電解質（pH3～10、pH5～8、pH4～6和pH5～7）、Ｔrisbase、苯甲基磺酰氟（PMSF）、尿素、硫脲、二硫蘇糖醇（DＴＴ）、碘乙酰胺、3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽（CHAPS）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）所需丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、礦物油、四甲基乙二胺（ＴEMED）、過硫酸銨、甘氨酸均購買自美國BioRad公司；甘油、溴酚藍、瓊脂糖均為國產(chǎn)分析純，所有溶液均以Milli-Q超純水系統(tǒng)制備的超純水為溶劑。

1.2儀器與設備

5800MALDI-ＴOF/ＴOF質譜儀，ABSCIEX公司；UＶ-2550型紫外可見分光光度計，日本島津公司；MILLI-QREFERENC超純水系統(tǒng)，美國密理博公司；GS-800-ＴM校正型光密度掃描儀，美國Bio-Rad公司；DL-1005型低溫冷卻液循環(huán)系統(tǒng)，上海漢諾儀器有限公司；PROＴEANIEF等電聚焦電泳儀，美國Bio-Rad公司；PROＴEAN83ⅡXL電泳槽，美國Bio-Rad公司；ZD-9556型水平脫色搖床，常州市凱航儀器有限公司；FE20pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；SORＶALLStratos冷凍高速離心機，美國Ｔhermo公司。

1.3試驗方法

1.3.1原料預處理

1.3.1.1鰱魚肌原纖維蛋白提取

參考李學鵬等的方法，取魚肉20g并絞碎。加入5倍體積10mmol/L的Ｔris-HCl（pH7.2），高速均質2min，每隔30s，停30s。在5000r/min、4℃條件下離心15min。取沉淀，在沉淀中加入3倍體積的ＴrisHCl（含0.6mol/LNaCl，10mmol/LＴris，pH7.2）緩沖液，高速均質，后在4500r/min、4℃條件下離心15min，雙縮脲法測定其濃度。取上清液貯藏在-80℃冰箱中備用。

1.3.1.2堿性蛋白酶處理

將干酶粉稀釋至0.01g/mL，并取20mL肌原纖維蛋白溶液，添加相當于蛋白質質量0.1%的堿性蛋白酶酶液，置于磁力攪拌器上，分別在4℃和25℃下反應。堿性蛋白酶處理時間分別為：4℃選取0，1，2h；25℃選取0，0.5，1h。反應結束后立即加入適量50mmol/LPMSF抑制酶活。

1.3.2雙向電泳

1.3.2.1等電聚焦程序

參考Bio-Rad公司雙向電泳操作技術手冊及本團隊前期已探索出鰱魚肌原纖維蛋白的雙向凝膠電泳技術（twodimensionalgelelectrophoresis，2-DE）進行試驗。將適量的已定量蛋白質溶液與水化上樣緩沖液（含7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、65mmol/LDＴＴ、0.2%載體兩性電解質和0.001%溴酚藍）充分混合，采用17cm，pH4～7的IPG預制干膠條進行等電聚焦，100μg，300μL主動水化上樣，顯色方式為硝酸銀染色。等電聚焦程序參數(shù)設置如表1所示。

1.3.2.2膠條平衡

等電聚焦結束后，每根膠條用6mL膠條平衡緩沖液Ⅰ〔6mol/L尿素、2%SDS、0.375mol/LＴris-HCl（pH8.8）、20%甘油和2%DＴＴ〕和緩中液Ⅱ[6mol/L尿素、2%SDS、0.375mol/LＴris-HCl（pH8.8）、20%甘油和2.5%碘乙酰胺]進行膠條平衡，每次14min。

1.3.2.3第二向SDS-PAGE垂直凝膠電泳

將平衡完畢的膠條于1×電極緩沖液（含3g/LＴrisbase、14.4g/L甘氨酸、1g/LSDS）中洗去多余平衡液，分別轉移至提前制好的第二向10%，12%，15%聚丙烯酰胺分離膠上端，并加入低熔點瓊脂糖封膠液（0.5%低熔點瓊脂、25mmol/LＴris-base、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS和0.001%溴酚藍），排除氣泡，待其徹底凝固后，轉移至垂直電泳槽中，恒壓進行第二向SDS-PAGE，程序見表2。

1.3.2.4銀染、凝膠成像及分析

采用參考文獻的方法并略有修改。將銀染后的凝膠轉至GS-800凝膠掃描成像儀投射平臺上。

采用PDQuest8.0二維凝膠圖像專業(yè)分析軟件對所得圖像進行背景消減、蛋白點檢測和匹配等處理，尋找差異蛋白點。

1.3.3差異蛋白點的質譜鑒定

1.3.3.1酶解

參考Addis等和Bernevic等的方法，從銀染的凝膠上得到蛋白質點，放入硅化處理過的1.5mL微量離心管中，用超純水反復漂洗后，對該蛋白點進行膠內酶切。

1）脫色

在放有蛋白點的離心管中，加入50μL脫色液[15mmol/LK3Fe（CN）6溶于50mmol/LNa2S2O3中]，將蛋白點的棕色脫色至淡綠色，用超純水漂洗以終止反應，直至蛋白點變?yōu)闊o色透明。然后將蛋白點所附著的丙烯酰胺切碎，用100mmol/LNH4HCO3漂洗，并用100%乙腈（色譜純）脫色至丙烯酰胺凝膠顏色變白，隨后將其置于冷凍真空干燥器中進行凍干。

2）酶解

用pH8.0的胰蛋白酶液（以50mmol/L碳酸氫銨溶液為溶劑）將凍干的樣品于37℃酶解過夜。每個蛋白點胰蛋白酶用量根據(jù)蛋白點大小，每個蛋白點約40～100ng胰蛋白酶。

3）萃取

酶解后的肽段用60μL5%ＴFA和50%乙腈進行萃取，重復2次，每次15min，合并萃取液并真空抽干。

4）樣品復溶與脫鹽

采用0.1%ＴFA溶液將干燥后的樣品再次復溶，并用ZipＴIP移液嘴脫鹽。將1μL除鹽后的樣品置于質譜樣品板上進行自然干燥，進行MALDI-ＴOF/ＴOF分析，檢測條件見表3。

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