3食品源性成分的鑒定

由于市場(chǎng)需求擴(kuò)大和原料價(jià)格上漲，部分企業(yè)或商家為減少成本獲得高利潤(rùn)，加工過程中在食品中加入成本低廉的原料以次充好，因此對(duì)于食品源性成分快速準(zhǔn)確鑒定的需求與日俱增。目前常用檢測(cè)方法主要為qPCR法，該方法依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線且易被抑制劑影響。數(shù)字PCR技術(shù)可以彌補(bǔ)這些不足，在檢測(cè)過程中直接通過每個(gè)反應(yīng)單元中有無(wú)熒光信號(hào)進(jìn)行判讀，從而計(jì)算日標(biāo)含量，逐漸被應(yīng)用于食品源性成分鑒定的研究中。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中，利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)食品中動(dòng)、植物源性成分主要有兩種技術(shù)路線：一種是以DNA濃度為中間值，建立源性成分質(zhì)量M與DNA拷貝數(shù)C之問的線性關(guān)系M=AC+B(A、B為常數(shù))，再根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。該方法適用于大部分食品中源性成分的檢測(cè)，可檢測(cè)原材料復(fù)雜的食品中多種目標(biāo)源性成分。

Cai等所建立的雙重(ddPCR方法可同時(shí)檢測(cè)食品中牛肉及豬肉原料，具有良好的特異性和敏感性，在復(fù)雜基質(zhì)的樣品中也未觀察到熒光干擾現(xiàn)象，與前文所提到深加工食品中轉(zhuǎn)基因水稻檢測(cè)結(jié)果一致，驗(yàn)證了數(shù)字PCR方法不易受抑制劑及復(fù)雜基質(zhì)的影響。Shehata等將微滴數(shù)字PCR分析與內(nèi)部控制相結(jié)合，可在沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況對(duì)含有0．05％～1.0％(w／w)牛肉、火雞肉、豬肉、雞肉等肉類的食品及飼料等進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)。

李瑋琦等利用火雞的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3基因序列，建立了同時(shí)適用于cdPCR和ddPCR平臺(tái)的快速檢測(cè)方法，兩種方法均準(zhǔn)確檢測(cè)多種肉類混合產(chǎn)品中火雞肉質(zhì)量占5％及以上的產(chǎn)品，準(zhǔn)確性良好，也證實(shí)了同一方法在小同數(shù)字PCR平臺(tái)問的通用性?；谶@種路線，不僅可以檢測(cè)肉制品摻假情況，鑒別不同肉制品種類并對(duì)其定量，還能對(duì)植物源性成分進(jìn)行檢測(cè)，并準(zhǔn)確定量及定性分析植物飲料中摻假情況。

另一種路線則是根據(jù)兩種小同源性成分實(shí)際拷貝數(shù)來計(jì)算，不需要以DNA濃度為中間值。以任君安等對(duì)羊肉和豬肉的檢測(cè)為例，通過ddPCR測(cè)定單位質(zhì)量下羊肉和豬肉的基因拷貝數(shù)之比k，得到豬肉與羊肉質(zhì)量之比Mp：Mm=kQp:Qm，(Qp，為豬基因拷貝數(shù)，Mp為豬肉質(zhì)量，Qm為羊基因拷貝數(shù)，Mm為羊肉質(zhì)量)，最后用實(shí)際測(cè)得的拷貝數(shù)來計(jì)算羊肉和豬肉的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)證明數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)于羊肉中摻雜豬肉的含量檢測(cè)具有很好的檢測(cè)效率，可檢測(cè)到羊肉中豬肉含量1％的產(chǎn)品，在相對(duì)定最檢測(cè)范圍5％～80％(w/w)之間絕對(duì)誤差小。

該團(tuán)隊(duì)還對(duì)綿羊及山羊肉產(chǎn)品中雞肉的含量進(jìn)行了定最，比qPCR方法更準(zhǔn)確；且在不同熱處理和高壓下均有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，不同部位的肉對(duì)ddPCR方法的定量準(zhǔn)確性也沒有影響。劉立兵等16通過類似的方法對(duì)牛肉/豬肉人工混合樣本和市售牛肉制品中的豬肉成分進(jìn)行定量，結(jié)果良好，也證實(shí)了該方法的可行性。此外，數(shù)字PCR方法還可對(duì)食品成分的來源進(jìn)行鑒定，可用于地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。Scollo等建立ddPCR方法鑒別橄欖油來源并定最DNA拷貝數(shù)，最低測(cè)量值可達(dá)到稀釋度10-3，比原有的qRT-PCR方法低一個(gè)數(shù)量級(jí)。

還有研究者在先前研究基礎(chǔ)上對(duì)銀鯧魚進(jìn)行鑒別及定量，可準(zhǔn)確分辨銀鯧魚及其他具有高度同源序列的魚類，實(shí)驗(yàn)得到ddPCR的絕對(duì)檢測(cè)限為2copies/μL，與其他肉類檢測(cè)結(jié)果的1～5copies/μL相近，對(duì)魚肉及DNA混合物的敏感性分別為0.1％和0.5％(w/w)，且靈敏度是qPCR的156倍。

以上研究表明，在食品源性成分的定性及定景過程中，數(shù)字PCR方法可對(duì)較低含量成分進(jìn)行鑒別、定量，靈敏度及穩(wěn)定性優(yōu)于qPCR；抑制劑、加工條件及采樣部位對(duì)其重復(fù)性和穩(wěn)定性影響較小，能夠大幅提高食品摻假及食品成分來源鑒別的準(zhǔn)確性，為食品抽檢及大規(guī)模檢測(cè)提供更高效的方法，進(jìn)一步推動(dòng)食品質(zhì)量與安全管理。但食品加工過程中，長(zhǎng)時(shí)間高溫(超過15min)或超聲波處理(超過10min)及分析過程中限制性內(nèi)切酶的作用會(huì)使部分目標(biāo)DNA降解，影響擴(kuò)增效率導(dǎo)致最終讀數(shù)低于實(shí)際值，因此在分析過程中需要將DNA降解率降到最低。

4食源性致病微生物快速檢測(cè)

可引起食源性疾病的微生物是影響食品安全的主要因素之一，如沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌等。這些微生物廣泛存在于肉制品、奶制品、水產(chǎn)品、蔬菜等多種食品中，是引起食物中毒的主要致病微生物。盡管食品加工過程中對(duì)微生物污染嚴(yán)格控制，但仍無(wú)法完全避免食品污染引起的疾病或食品腐敗，甚至影響公眾健康，同時(shí)也為企業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)食品原料、加工環(huán)境及最終產(chǎn)品中可能存在的微生物進(jìn)行有效檢測(cè)至關(guān)重要，對(duì)確保食品安全性及保障食品品質(zhì)具有重要意義。

趙麗青等基于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌hlyA基因建立了ddPCR檢測(cè)方法，得到計(jì)算公式為：初始濃度(CFU/g)=檢測(cè)數(shù)據(jù)((copies/μL)×25，檢出限可以達(dá)到90UFU/mL，靈敏度非常高且重復(fù)性好，可高效、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中核細(xì)胞增生李斯特氏菌。此后，程逸宇等針對(duì)乳制品建立了單增李斯特氏菌的檢測(cè)方法，LOD為5×10²CFU/mL。

趙新等根據(jù)沙門氏菌invA毒力基因序列對(duì)沙門氏菌進(jìn)行快速檢測(cè)并與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10²CFU/mL，模擬污染沙門氏菌的金針菇樣品實(shí)測(cè)與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法對(duì)比符合率100％，可以在保障準(zhǔn)確性的同時(shí)節(jié)省大量時(shí)問。Wang等在列在其研究中也證明了數(shù)字PCR比qPCR節(jié)約2h左右預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，且最低檢出限可達(dá)到10²CFU/mL。

周巍等根據(jù)金黃色葡萄球菌nuc基因設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)體系，利用ddPCR方法對(duì)發(fā)酵乳中金黃色葡萄球菌nuc基因的檢測(cè)特異性和靈敏度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)限可達(dá)到3.3×10¹CFU/g，定最檢測(cè)結(jié)果精確，特異性好。魏詠新等建立的大腸桿菌0157:H7的ddPCR檢測(cè)技術(shù)的最低定量限為4.2拷貝/反應(yīng)，人工污染食品樣品的檢測(cè)限為11⁰CFU/g，適用于食品中高污染大腸桿菌0157:H7的定量檢測(cè)應(yīng)用，為大腸桿菌0157:H7的防控和監(jiān)管工作提供技術(shù)支持。除致病微生物外，酸奶、玫瑰醬等發(fā)酵食品中含有大黃益生菌，采用數(shù)字PCR技術(shù)可對(duì)其亞種進(jìn)行鑒別并測(cè)定含量。

與食品行業(yè)傳統(tǒng)培養(yǎng)法及qPCR方法相比，數(shù)字PCR從提取微生物DNA到檢測(cè)完成僅需1d，且靈敏度、精準(zhǔn)性及重復(fù)性優(yōu)于qPCR；數(shù)字PCR可使用雙蕈引物對(duì)微生物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，也與RT-PCR方法或疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide，PMA)等預(yù)處理方式結(jié)合，提高檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)對(duì)較少數(shù)最活細(xì)胞的定景。

數(shù)字PCR方法具有通過不同熒光信號(hào)、分區(qū)及信號(hào)通道改進(jìn)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)準(zhǔn)確量化的可能性，在對(duì)致病微生物單獨(dú)檢測(cè)的研究基礎(chǔ)上，可以設(shè)計(jì)針對(duì)不同探針或特異性基因片段的體系實(shí)現(xiàn)樣品中不同致病微生物的同時(shí)檢測(cè)，提升食品安全檢測(cè)的效率，對(duì)食品原料及加工過程中微生物的檢測(cè)、利用及標(biāo)準(zhǔn)化控制提供有益參考。

采用數(shù)字PCR方法僅能對(duì)食品中已知致病微生物進(jìn)行鑒別及定量，對(duì)于其他可能存在的未知微生物仍需采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行篩選鑒別。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)，數(shù)字PCR準(zhǔn)確定量的檢測(cè)限優(yōu)于qPCR一個(gè)數(shù)量級(jí)，但當(dāng)樣品濃度過低時(shí)檢測(cè)結(jié)果偏差較大，這可能是由于當(dāng)樣品濃度過低時(shí)在體系中過于分散，以致添加模板吸液時(shí)各平行樣中核酸量有差異。因此在檢測(cè)前可能需要對(duì)樣品濃度進(jìn)行估計(jì)，必要時(shí)要對(duì)樣品進(jìn)行富集。

5前景與展望

與傳統(tǒng)方法相比，數(shù)字PCR技術(shù)在檢出限、穩(wěn)定性等方面具有較大優(yōu)勢(shì)，但目前仍存在一些不足：商業(yè)化數(shù)字PCR儀器設(shè)備價(jià)格高，且需要芯片、微滴生成油等價(jià)格較高的特殊裝置來保證大最獨(dú)立反應(yīng)單元的形成，提高了檢測(cè)成本，這也是目前限制數(shù)字PCR技術(shù)大范圍應(yīng)用的主要因素；數(shù)字PCR也是基于普通擴(kuò)增的原理，無(wú)法避免常規(guī)PCR過程中也會(huì)出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”結(jié)果；在操作過程中，生成微滴數(shù)最不達(dá)標(biāo)、產(chǎn)生氣泡、微滴破裂、引物保存不當(dāng)、污染等均會(huì)影響最終檢測(cè)結(jié)果，對(duì)操作人員及檢測(cè)過程有更高要求。因此，要優(yōu)化儀器來降低檢測(cè)成本、對(duì)操作人員進(jìn)行規(guī)范化培訓(xùn)以避免操作誤差，從而提高數(shù)字PCR可用性。

總體而言，數(shù)字PCR方法在食品定景及定性分析方面具有巨大潛力，雖然存在一些問題，但隨著制造技術(shù)的發(fā)展、數(shù)字PCR儀的優(yōu)化以及檢測(cè)人員的專業(yè)化系統(tǒng)化培訓(xùn)，數(shù)字PCR技術(shù)能夠在未來為科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用提供更多可能的方法，解決更多難題。數(shù)字PCR儀也將逐漸在基層檢測(cè)及研究機(jī)構(gòu)中投入使用，為食品安全檢測(cè)、食品質(zhì)最控制提供高效可行的手段，對(duì)于食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)制定及食源性疾病預(yù)防具有重要意義。

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