紅花，為一年生草本菊科紅花屬植物，植株呈冠狀，主莖強壯，花絲多呈紅、桔紅、桔黃、黃、淺黃、白等色。種子為瘦果，種皮色分白、灰、黑、黑褐，花期為每年的6～7月份，果期為8～9月份。紅花籽粕是紅花籽提油后的副產(chǎn)品，榨油后的紅花籽粕有兩種：即帶殼籽粕和去殼籽粕，其中帶殼的蛋白質(zhì)含量為19%，而去殼的蛋白質(zhì)含量高達40%。即使帶殼籽粕的營養(yǎng)價值也可以與苜蓿相媲美，在畜牧業(yè)中用作飼料添加，可為肥育牲畜的飼料；而去殼籽粕則更與亞麻子油餅相似，在母雞飼料中可直接代替蛋白質(zhì)添加。有報道稱，通過對部分市售紅花籽粕的研究，營養(yǎng)指標(biāo)測定如下：其中粗蛋白質(zhì)20%、粗纖維31%、粗蛋白消化率78%、粗纖維消化率14.3%，由于其消化率較高，特別適用于作為奶牛飼料，對產(chǎn)奶量及品質(zhì)都有很大程度的提高，是一種非常具有開發(fā)價值的副產(chǎn)品；紅花籽粕所含蛋白氨基酸屬于完全氨基酸，含有人體所需的18種氨基酸，其中8種必需氨基酸含量較高，約占氨基酸總量的30%左右；此外，紅花籽粕在農(nóng)業(yè)中可用做抗凍劑、抗蟲劑和有機肥料等。

紅花籽粕含有豐富的蛋白，其制備成的抗氧化肽具有較強的還原力，國內(nèi)對紅花籽粕蛋白利用研究的比較少，為提高紅花籽粕利用前景，本研究選取木瓜蛋白酶，并加入超聲輔助水解，對紅花籽粕蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，為紅花籽粕的綜合利用及開發(fā)相關(guān)高附加值的功能性食品提供技術(shù)依據(jù)。

一、實驗材料與方法

1、材料與儀器

紅花籽粕：新疆產(chǎn)地；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草芽孢桿菌中性蛋白酶：上海多比實業(yè)有限公司；三氯化鐵、鐵氰化鉀、30%過氧化氫、硫酸、硼酸、鹽酸、磷酸氫二鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、酚酞、三氯乙酸、甲醛、堿性品紅、磷酸二氫鈉：購于鄭州萊博儀器設(shè)備有限公司；試劑均為分析純。UNIVERSAL320高速冷凍離心機：Hettich有限公司；AUY120分析天平：SHIMADZUCORPOPATIONJAPAN；722E可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；ALPHAL-2真空冷凍干燥機：德國M.CHRIST公司；HH恒溫水浴鍋：江蘇金壇中大儀器廠；PHS-25酸度計：上海雷磁儀器廠：C21-IH02E9電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司；YP202N電子天平：上海精密儀器儀表有限公司。

2、實驗方法

（1）試劑的配制

pH7.0磷酸鹽緩沖液：量取61mL的0.02mol/L磷酸氫二鈉溶液和39mL的0.02mol/L磷酸二氫鈉，混合均勻，即為pH7.0磷酸鹽緩沖液。

0.02mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.8g氫氧化鈉溶于水，定容至100mL。0.05mol/L甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取375mg甘氨酸，溶解后定容至10mL。400mL中性甲醛溶液：在50mL36%～37%分析純甲醛溶液中加入1mL0.5%酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氫氧化鈉溶液滴定到微紅，貯于密閉的玻璃瓶中。

（2）紅花籽粕酶解液的制備

提油后的紅花籽粕用高速粉碎機進行粉碎，過50目篩，取2.5g紅花籽粕于小燒杯中，加入50mLpH7.0的磷酸緩沖溶液，于水浴鍋55℃水解1h，滅酶活（100℃，10min）在10000r/min轉(zhuǎn)速下冷凍離心15min，取上清液，備用。

（3）酶活力的測定

①超聲波前后酶活力的測定

準(zhǔn)備6支干凈的試管，分別取酶液1mL于試管中，木瓜酶液、中性酶液、胰蛋白酶液各兩支試管，其中三支作空白對照，另外三支依次加入3mLpH7.0磷酸緩沖液，37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，加入pH7.0磷酸緩沖液配制的1%酪蛋白溶液1mL，搖勻，37℃水浴10min或55℃條件下用超聲波處理10min，，取出加入10mLTCA（三氯乙酸）溶液終止反應(yīng)，劇烈搖動，37℃水浴半小時，冷凍離心取上清液作7倍稀釋，275nm處測吸光度值A(chǔ)?？瞻讓φ眨涸诩尤氲孜镏凹尤隩CA溶液。

②蛋白酶酶活力計算

準(zhǔn)備6支干凈的試管，分別取酶液1mL于試管中，木瓜酶液、中性酶液、胰蛋白酶液各兩支試管，其中三支作空白對照，另外三支依次加入3mLpH7.0磷酸緩沖液，37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，加入pH7.0磷酸緩沖液配制的1%酪蛋白溶液1mL，搖勻，37℃水浴10min或55℃條件下用超聲波處理10min，，取出加入10mLTCA（三氯乙酸）溶液終止反應(yīng)，劇烈搖動，37℃水浴半小時，冷凍離心取上清液作7倍稀釋，275nm處測吸光度值A(chǔ)?？瞻讓φ眨涸诩尤氲孜镏凹尤隩CA溶液。每分鐘水解產(chǎn)生1µg酪氨酸所需的酶量，即為1個酶活單位（U）。由酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（A=aC+b）及酶活定義推得：

酶活=（A-b）×N/（a·水解時間）（1）

式中N為稀釋倍數(shù)8；

A為吸光值；

酶活單位為U/mL。

（4）L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1g，用20mL1mol/L鹽酸溶解后，再用蒸餾水定容至100mL，即為1mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取1mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL，用0.1mol/L鹽酸定容至100mL，即得到100µg/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取100µg/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5、6mL于10mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成每毫升分別含L-酪氨酸0、10、20、30、40、50、60µg的標(biāo)準(zhǔn)使用液，在275nm下測定各濃度酪氨酸溶液的吸光值，以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，以該濃度下溶液所對應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和R2值。

（5）水解度的確定。

水解度DH=游離氮/總氮

①測總氮量（凱氏定氮法）

參考GB5009.5進行總氮的測定，在進行樣品測定的同時做試劑空白，計算總氮含量。

②甲醛滴定法測定游離氮

移取2mL抽濾的水解液，分別置于250mL的錐形瓶中，加水25mL；其中一份加3滴中性紅指示劑，用標(biāo)定的NaOH溶液滴定至琥珀色為終點。另一份加入中性甲醛10mL及3滴百里酚酞指示劑，搖勻，靜置1min，（此時藍(lán)色消失）。再用上述標(biāo)定過的NaOH溶液滴定至淡藍(lán)色。記錄兩次滴定所消耗的NaOH的毫升數(shù)，計算游離氮的含量。

（6）還原力的測定

配制一系列濃度為5%的紅花籽粕底物溶液（取2.5g籽粕，加緩沖液50mL），分別加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，先調(diào)節(jié)pH，進行超聲波處理10min，水解反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束以后經(jīng)過100℃滅酶處理10min，在10000r/min轉(zhuǎn)速下進行冷凍離心，時間為15min，上清液經(jīng)過冷凍干燥后備用。選用上清液來測定酶解液的還原能力。

取上清液備用，將酶解液稀釋1倍，取1.0mL紅花籽粕酶解液于10mL的試管中，依次加入0.2mol/LpH6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL并且充分混合均勻，于50℃條件下水浴保持20min，并迅速冷卻，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸溶液2.5mL，并且充分混合均勻，在3000r/min轉(zhuǎn)速冷凍離心10min。吸取離心后的上清液2.5mL，加入蒸餾水2.5mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%三氯化鐵溶液0.5mL，靜置10min，在700nm波長下測定溶液吸光值，所有測定值均為三次數(shù)據(jù)平均值。以700nm波長處的吸光值大小來反映酶解液的還原力的大小，吸光值越大，表明酶解液的抗氧化性越強。

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