目的研究神農(nóng)架產(chǎn)睡菜Menyanthestrifoliate全草醋酸乙酯部位的化學(xué)成分及其神經(jīng)保護(hù)作用。方法采用薄層色譜，正相硅膠、AB-8大孔樹脂、SephadexLH-20葡聚糖凝膠及制備型HPLC等柱色譜方法分離純化，利用NMR、MS等波譜學(xué)方法鑒定化合物結(jié)構(gòu)。采用體外建立皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型，運用MTT方法的單體化合物對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用進(jìn)行初步確認(rèn)。結(jié)果從睡菜醋酸乙酯部位中得到了21個化合物，分別鑒定為4-O-咖啡酰奎尼酸甲酯（1）、綠原酸甲酯（2）、綠原酸（3）、異秦皮素（4）、異嗪皮啶（5）、7R,7′R,8S,8′S-(＋)-新-橄欖脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（6）、腫柄雪蓮苷（7）、丁香脂素（8）、蘇式-(7R,8R)-愈創(chuàng)木基丙三醇-8-香草醛醚（9）、(7S,8R)-二氫去氫二松柏醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（10）、(-)-落葉松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（11）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（12）、槲皮素-3-O-蕓香糖苷（13）、去氫吐葉醇（14）、布盧門醇A（15）、黑麥草內(nèi)酯（16）、(E)-6-羥基-2,6-二甲基辛-2,7-二烯酸甲酯（17）、3-甲氧基酚-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（18）、2-羥基苯并咪唑（19）、丁香醛（20）、1-苯基-1,2-乙二醇（21）。對化合物1～21進(jìn)行了皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用研究，結(jié)果顯示，化合物1、2、3、7、9對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用，化合物4、5、10、11、15～17表現(xiàn)出中等的保護(hù)作用。結(jié)論 化合物1～9、11～12、14～21為首次從該植物中分離得到。

睡菜Menyanthes trifoliate L.為龍膽科睡菜屬多年生水生植物，廣布于北半球溫帶地區(qū)，我國西藏、云南、四川、貴州、黑龍江、吉林、遼寧及鄂西地區(qū)均有分布。又名“醉草、綽菜、瞑菜”?！侗静菥V目》記載：睡菜性甘微苦，寒，無毒，以單方入藥，治心膈邪熱，不得眠；《北方常用中草藥手冊》曰：睡菜味甘微苦，性溫，無毒，能健脾消食，養(yǎng)心安神，治胃炎，胃痛，消化不良，心悸失眠，心神不安。據(jù)《南方草木狀》記載：“睡菜，夏生于池沼間，葉類慈姑，根如藕條，南海人食之，云令人思睡，呼為瞑菜”。睡菜在民間藥食兩用。我國民間部分省市有采集睡菜做泡菜的習(xí)俗，吃后較為嗜睡，可以治療失眠，有養(yǎng)心安神的功效。睡菜中主要含有環(huán)烯醚萜、揮發(fā)油、生物堿、甾體等類成分。

本課題組在前期研究中已證實睡菜提取物毒性較小且具有良好的鎮(zhèn)靜催眠活性，其中的醋酸乙酯部位具有顯著地鎮(zhèn)靜催眠活性?！秵桚S醫(yī)案》所云：“動甚則怔仲，令人惶惕不安，凄愴不樂，甚至心煩慮亂，不知所從，無故多思，寤不成寐”。闡明了焦慮與失眠有著密切聯(lián)系，并在病因病機(jī)方面有著共通之處。有研究顯示，失眠作為一項獨立的危險因素，在焦慮狀態(tài)的發(fā)病過程中起著決定性的作用。PC12細(xì)胞株來源于一種可移植的鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，分化的PC12細(xì)胞具有典型的神經(jīng)元的功能，被廣泛用于神經(jīng)細(xì)胞分化、離子通道、受體、遞質(zhì)等研究領(lǐng)域。皮質(zhì)酮是一種糖皮質(zhì)激素，可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的病理損傷，從而誘導(dǎo)焦慮行為。這一特點使得高濃度皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷可模擬焦慮癥神經(jīng)細(xì)胞損傷狀態(tài)。因此本研究通過建立皮質(zhì)酮損傷的PC12細(xì)胞模型探究睡菜中抗焦慮活性有效物質(zhì)，該研究結(jié)果為深入開發(fā)利用睡菜植物資源，以期發(fā)現(xiàn)具有抗焦慮活性的天然活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

Bruker AV 400型核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；Thermo ISQ LT單四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國賽默飛公司）；Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；Waters 1525 EF高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Venusil XBP C18色譜柱（半制備型；250 mm×10 mm，10 μm；分析型：250 mm×4.6 mm，5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）；低溫冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）；TECAN infinite F200 PRO酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）；熒光顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司XD30A-RFL）；CO2培養(yǎng)箱（德國binder公司）；低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（上海民橋精密儀器有限公司）；正相色譜硅膠（煙臺化學(xué)工業(yè)研究所）；反相色譜硅膠（日本YMC公司）；Sephadex LH-20（美國Pharmacia公司）；MCI GEL（日本三菱化學(xué)）；1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；皮質(zhì)酮（美國Medchemexpress公司）；MTT（美國Amersco公司）；DMSO（美國Sigma公司）；高效液相用乙腈、甲醇均為色譜純（美國Tedia公司）；水為三蒸水；其他試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。
睡菜全草于2018年9月采自湖北省神農(nóng)架大九湖，經(jīng)三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院王玉兵博士鑒定為龍膽科睡菜屬植物睡菜M. thestrifoliate L.的全草。植物標(biāo)本現(xiàn)保存于三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室。
PC12高分化細(xì)胞，為三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。接種于含10%胎牛血清，2%谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 提取與分離

睡菜干燥全草（6.3 kg）粉碎，用95%乙醇回流提取3次（60 L×3），每次2 h。將乙醇提取液減壓濃縮干燥，得到睡菜醇提總浸膏1514 g，總浸膏加水均勻混懸，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液減壓濃縮，得到石油醚萃取部位102 g、醋酸乙酯萃取部位172 g、正丁醇萃取部位350 g。

取醋酸乙酯萃取部位160 g，純水溶解后，AB-8大孔吸附樹脂柱色譜分離，依次用純水、20%乙醇水、40%乙醇水、60%乙醇水、80%乙醇水、100%乙醇洗脫，減壓濃縮干燥，得到純水洗脫部位（13 g）、20%乙醇水洗脫部位（6 g）、40%乙醇水洗脫部位（34 g）、60%乙醇水洗脫部位（23 g）、60%乙醇水洗脫部位（30 g）、100%乙醇洗脫片段（50 g）。取40%乙醇水洗脫部位，用C18反相硅膠柱色譜分離，水-甲醇梯度洗脫，經(jīng)HPLC分析合并，得到10個組分Fr. C1～C10。Fr. C3（1500 mg）經(jīng)HW-20F凝膠柱分離，得到Fr. C3a～C3i；Fr.C3a經(jīng)制備型HPLC（乙腈-水18∶82）純化，得到化合物7（2.1 mg）、13（9.1 mg）、18（1.1 mg）、21（5.2 mg）；Fr.C3b經(jīng)制備型HPLC（乙腈-水20∶80）純化，得到化合物2（24.4 mg）、5（5.3 mg）；Fr.C3e經(jīng)制備型HPLC（乙腈-水22∶78）純化，得到化合物1（3.3 mg）、4（3.2 mg）、14（4.9 mg）、15（3.8 mg）；Fr.C3i經(jīng)制備型HPLC（乙腈-水23∶77）純化，得到化合物12（3.1 mg）、16（3.2 mg）、19（2.5 mg）。Fr.C6經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜分離，得到Fr.C6a～C6d。Fr.C6c經(jīng)制備型HPLC（乙腈-水＝24∶75）純化，得到化合物3（11.7 mg）、8（3.1 mg）、9（3.1 mg）、10（8.1 mg）、11（30.1 mg）；Fr.C6d經(jīng)制備型HPLC（乙腈-水24∶76）純化，得到化合物6（10.1 mg）、17（3.9 mg）、20（2.3 mg）。

2.2 活性測試

2.2.1 皮質(zhì)酮對PC12細(xì)胞的濃度選擇

將濃度為1.5×105個/mL的處于對數(shù)生長期PC12細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為450、550、650、750、850、950、1050、1150 μmol/L皮質(zhì)酮溶液，培養(yǎng)48 h后，每孔加入25 μL MTT（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震搖10 min后，于酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測吸光度值。

2.2.2 實驗分組及藥物處理

將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞以1.5×105個/mL細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為正常對照組、模型組（650 μmol/L皮質(zhì)酮）、實驗組（650 μmol/L皮質(zhì)酮加200 μmol/L單體化合物1～21），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.2.3 MTT法檢測單體化合物對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用

PC12細(xì)胞按照“1.3.3”項方法處理后，每孔加入25 μL MTT（5 mg/mL）繼續(xù)作用4 h后，棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震搖10 min后，于酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測吸光度值。

2.2.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行one-way ANOVA比較分析，并釆用數(shù)據(jù)分析軟件Graphpad Prism 5.03 Turkey′s t-test檢驗進(jìn)行組間顯著性分析，實驗數(shù)據(jù)表示為（均值±標(biāo)準(zhǔn)差），當(dāng)P＜0.05時，不同實驗組間存在統(tǒng)計學(xué)意義。

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