復(fù)雜樣品中痕量農(nóng)藥殘留的分離、凈化和濃縮是農(nóng)藥殘留分析中最繁雜的工作，對分析的準確性和可靠性影響很大。傳統(tǒng)的分離凈化手段如液液分配、薄層色譜、柱色譜凈化等費時費力，需要使用較多的有機溶劑，復(fù)雜的樣品前處理過程還容易造成痕量目標分析農(nóng)藥的變性和損失。同相萃取等方法利用目標分析物與雜質(zhì)理化性質(zhì)的差異實現(xiàn)分離凈化，其選擇性仍然有限，對于一些理化性質(zhì)相近的非目標分析物還是難以有效分離去除，對后續(xù)的分析會產(chǎn)生干擾。因此研究開發(fā)具有高選擇性分離富集功能的農(nóng)藥殘留分離凈化技術(shù)是農(nóng)藥殘留分析技術(shù)的重要研究內(nèi)容之一。

一、免疫親和色譜

Axen等(1967)和Cuatrecasas(1968)的開拓性工作奠定了免疫親和色譜(immuno-affinity chromatography，IAC)的研究基礎(chǔ)。從20世紀80年代后期開始，免疫親和色譜作為一項頗具發(fā)展?jié)摿Φ母咝Х蛛x富集技術(shù)受到關(guān)注，國內(nèi)外已有不少關(guān)于應(yīng)用免疫親和色譜法分離富集不同物質(zhì)的文獻報道，對復(fù)雜樣品提取液中的目標分析農(nóng)藥、獸藥、毒素、各種蛋白質(zhì)等具有顯著的分離純化效果，富集效率高。蛋白質(zhì)粗提液經(jīng)過免疫親和色譜凈化，可達到電泳純水平，并具有很高的回收率。因此免疫親和色譜在醫(yī)學(xué)檢驗、食品衛(wèi)生檢驗、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有很高的研究應(yīng)用價值。

(一)免疫親和色譜基本原理及主要特點

免疫親和色譜是利用抗原與抗體的高親和性、專一性和可逆結(jié)合的原理而建立的一種色譜方法。農(nóng)藥的免疫親和色譜是以抗農(nóng)藥特異性抗體為配體，將其固定到適當?shù)墓滔噍d體上，制備免疫親和色譜固定相和免疫親和色譜柱，利用農(nóng)藥小分子的反應(yīng)原性和抗原抗體結(jié)合的特異性以及在一定條件下可逆解離的原理進行色譜分離。當含有目標分析農(nóng)藥的粗提液經(jīng)過免疫親和色譜柱時，樣液中對該抗體有親和性的農(nóng)藥就被選擇性地結(jié)合到同定相上，淋洗去除非目標分析物后，在適當條件下用少量溶劑洗脫，可選擇性地分離富集目標分析農(nóng)藥。免疫親和色譜通常只需“加樣-洗滌-洗脫”一步色譜就可使復(fù)雜樣品中極微量的特定組分得到高度純化和濃縮，所得分離物比固相萃取物純度高，濃縮倍數(shù)可達數(shù)百甚至上千倍，便于直接采用氣相色譜、高效液相色譜等方法進行檢測，大大提高了樣品前處理效率，減少了有機溶劑的使用和提取過程中目標分析物的損失，具有特異性強、柱容量大、洗脫條件溫和等特點。免疫親和色譜柱還可以很方便地再生和重復(fù)利用，非常適用于復(fù)雜樣品中痕量農(nóng)藥殘留的分離與富集，可有效降低樣品分析的檢測限，提高分析靈敏度。

(二)農(nóng)藥免疫親和色譜法的建立

1、抗農(nóng)藥抗體的制備與純化

在農(nóng)藥的免疫親和色譜中，作為固定相配體的抗農(nóng)藥抗體是最為關(guān)鍵的材料。合成保持并突出目標分析農(nóng)藥結(jié)構(gòu)特征的半抗原，將半抗原共價結(jié)合到一個大分子載體(如牛血清白蛋白等)上制備人工抗原，以人工抗原免疫動物或采用雜交瘤技術(shù)制備對目標分析農(nóng)藥具特異性親和力的多克隆(polyclona1 antmody，PcAb)或單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)。從20世紀90年代開始，利用基因工程技術(shù)制備抗體的研究工作逐漸開展起來，這無疑會為規(guī)模化生產(chǎn)高性能抗體和免疫親和色譜柱開辟了一條新途徑。

抗體的純度是制備高容量、高選擇性免疫親和色譜柱的主要因素之一。采用硫酸銨三步鹽析法從抗血清中分離出的抗體，須進一步純化后才能作為配體，用于制備免疫親和色譜固定相?？贵w的純化方法包括二乙氨乙基纖維素吸附法、離子交換柱色譜法及親和色譜法。二乙氨乙基纖維素對血清蛋白的吸附力遠高于對免疫球蛋白(IgC)的吸附力，可以有效去除血清中的非免疫球蛋白。蛋白A和蛋白G與IgC有很強的親和力，以蛋白A或蛋白G為配體的親和色譜，條件溫和，可以有效純化抗體并保持抗體的免疫學(xué)活性。以人工抗原作為配體的親和色譜，也是獲得高活性純化抗體的有效途徑之一。一般情況下，以農(nóng)藥半抗原與載體蛋白的耦聯(lián)物為人工抗原，以該人工抗原免疫動物制備多克隆抗體，其中有一部分抗體可能是針對載體蛋白的。所以可在抗血清或多克隆抗體溶液中加入適量載體蛋白進行反應(yīng)，然后離心去除載體蛋白一抗體復(fù)合物，再分離去除雜蛋白，可使抗目標分析農(nóng)藥的特異性抗體得到純化。

2、免疫親和色譜固相基質(zhì)的選擇

近年來，商品化的免疫親和色譜固相基質(zhì)越來越多。理想的免疫親和色譜固相基質(zhì)應(yīng)該具備的條件有：①親水性好，以便與親水性的配體(抗體)和水溶液中的目標分析物有較好的相容性；②其載體本身對非目標分析物沒有吸附或非特異性吸附非常?。虎劬哂羞m當數(shù)量的化學(xué)基團可供活化以便與適當數(shù)量的配體有效耦聯(lián)；④有較好的物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，能耐受配體固定化和親和色譜中可能采用的各種條件(如pH、離子強度、溫度、洗脫劑等)的影響；⑤具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠耦聯(lián)更多的配體，被親和吸附的目標分析物能夠自由地通過，從而增大配體與目標分析物的結(jié)合量；⑥有良好的機械性能，能夠承受一定的柱壓，在使用條件下不變形，保持穩(wěn)定的柱體積。為使流動相有較好的流速，免疫親和色譜固相基質(zhì)最好是均一的球狀顆粒。

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